膠質瘤是中樞神經系統（CNS）的實體瘤。它們來自膠質細胞的腫瘤性轉化，即星形膠質細胞、少突膠質細胞和室管膜細胞。腦腫瘤約占所有成人癌癥的2%，但在兒童腫瘤組中占較大比例。膠質瘤約占所有惡性腦腫瘤的80%，根據細胞起源、分化和惡性程度分類。膠質瘤在發病年齡、嚴重程度、組織學特征、進展和轉移能力方面表現出相當大的差異。膠質瘤診斷后的生存時間因級別而異。

根據世界衛生組織（WHO）的分類，膠質瘤分為四個等級。1、2 和3級被歸類為低級別膠質瘤，而4級被歸類為高級別膠質瘤。不幸的是，由于治愈性治療的可能性有限，高級別膠質瘤的目前預后還很差。常見的膠質瘤形式是星形細胞瘤，約占所有膠質瘤的50%。

4級星形細胞瘤也稱為膠質母細胞瘤或多形性膠質母細胞瘤(GBM)。GBM是常見和惡性的組織學類型，占5年生存率非常差（低于5%）的膠質瘤的65%根據血小板衍生生長因子受體（PDGFR）、神經絲輕鏈（NFL）、表皮生長因子受體（EGFR)和CD44。神經膠質瘤的前神經向間充質轉變與侵襲性表型、不良預后和治療抗性有關。

膠質瘤的分類和分子病理學關鍵研究靶點
自2008年以來，世界衛生組織  (WHO)  對腦腫瘤的分類一直持續到今天，新的第五版  (WHO  CNS5, 2021) 更新后的分類強調需要基于組織學和分子遺傳學特征對神 經膠質瘤進行分類，以用于臨床診斷和結果預測。 在 WHO CNS5 2021 版中，一些 IHC 診斷和預后標志物已被添加到膠質瘤的診斷標準中。新的膠質瘤分類如下圖所示，總共可分為7層。

圖1. 基于WHO組織CNS52021神經膠質瘤分類的7層方法

圖2. 成人彌漫性膠質瘤的七層分類方法。對于膠質瘤的綜合診斷，7層結構結合了組織學特征、分級和分子信息。每種腫瘤相關的診斷分子改變的存在和缺失分別用綠色和紅色標出。根據WHO分類，膠質瘤分級為2-4級，惡性程度增加。

針對ATRX、IDH1 (IDH/R132H) 和組蛋白 H3 (H3K27M)的突變形式的抗體用于檢測各自的突變。1p和19q染色體臂缺失的分析是通過多重連接依賴性探針擴增(MLPA)或不太常見的熒光原位雜交來完成的。不同形式的膠質瘤之間的區別主要基于形態特征、突變和染色體畸變（圖3）。 

圖3. 高等級膠質瘤的分子病理學

在膠質瘤神經的病理學診斷中，針對以下蛋白質的抗體，如IDH（異檸檬酸脫氫酶）、ATRX（alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked）、GFAP（glial fibrillary acidic protein)、SYN（synaptophysin、EGFR（(epidermal growth factor receptor）、p53(tumor suppressor protein 53）和增殖標志物Ki-67(MKI67)是黃金標準并經常使用。

免疫組織化學(IHC)在區分不同腫瘤類型方面起著至關重要的作用。下圖顯示了IDH1、ATRX和GFAP多重IHC-IF染色在不同膠質瘤等級中的一些示例。

圖4a.星形細胞瘤中的ATRX和GFAP。星形細胞瘤的多重IHCIF染色顯示腫瘤細胞中的ATRX（核，紅色）和 GFAP（細胞 質，綠色）免疫反應性。圖4b.少突膠質細胞瘤中的ATRX和IDH1。間變性少突膠質細胞瘤的多重IHC-IF染色顯示腫瘤細胞中的ATRX（核，紅色）和IDH1（細胞質，綠色）免疫反應性。

圖4c.膠質母細胞瘤中的ATRX和GFAP。多形性膠質母細胞瘤的多重IHCIF染色顯示腫瘤細胞中的ATRX（核，紅色）和GFAP （細胞質，綠色）免疫反應性。圖4d.膠質母細胞瘤中的ATRX和IDH1。膠質母細胞瘤進行多重IHC-IF染色，顯示腫瘤細胞中的ATRX（紅色）和IDH1（綠色）免疫反應性。

成人和兒童神經膠質瘤的特征
WHO  CNS5  2021  腦腫瘤分類的一個重要更新是將彌漫性神經膠質瘤區分為成人型和兒童型，它們對治療和結果都有不同的反應（圖5）。不同形式的膠質瘤的區分主要基于形態特征；然而，IHC分析在區分不同腫瘤類型方面起著至關重要的作用，尤其是在腫瘤分化差的情況下。

圖5. 膠質瘤根據細胞來源類型、分化程度和惡性程度進行分類。膠質瘤的類型、等級和分子特征決定了診斷和治療方案。基于綜合分子分析，成人彌漫性浸潤性神經膠質瘤根據起源、異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變、ATRX和1p/19q表達分為三個總體組。在兒科人群中，彌漫性膠質瘤分為低級別膠質瘤和高級別膠質瘤。 

許多報告強調了成人和兒童膠質瘤的顯著差異，主要基于組織學觀察、頻率、位置和病理譜。例如，小兒高級別膠質瘤通常出現在成人疾病很少靶向的大腦區域。 小兒彌漫性神經膠質瘤更復雜，在分子上與成人不同。小兒神經膠質瘤通常分為低級別和高級別，其特點是局限性生長和頻繁的H3和BRAF基因融合或突變。 

另一方面，成人原發性膠質母細胞瘤中常見的PTEN突變和EGFR擴增在兒童中不太常見（Pollack  2006）。此外，在成人中，繼發性膠質母細胞瘤很少包含EGFR擴增。TP53、CDKN2A和PIK3CA的突變在成人和兒童高級別膠質瘤中很常見。此外，血小板衍生的生長因子受體-α(PDGFR-α)是高級別兒童膠質瘤病灶放大的主要靶標，可能是兒科人群的重要靶標。 

基因拷貝數的改變可以顯著區分兒童和成人膠質母細胞瘤。在兒科腫瘤中未發現IDH1熱點突變，突出了與成人繼發性膠質母細胞瘤的分子差異。1q染色體的頻繁增加以及7號染色體增加和10q缺失的較低頻率也清楚地區分了兒童期和成人高級別膠質瘤。 

神經膠質瘤的蛋白質組
膠質瘤蛋白質組在人類蛋白質圖譜 (The Human Protein Atlas, HPA) 網站。它建立在癌癥基因組圖譜計劃 (TCGA) 提供的GBM數據之上，并將轉錄組數據與基于抗體的蛋白質數據相結合。 

轉錄組分析顯示所有人類基因（n=20090）中有72%（n=14370）在神經膠質瘤中表達。圖6顯示了膠質瘤中升高和預后（不利和有利）基因的數量。

圖6.膠質瘤中升高的和預后基因。

高級別(GBM)和低級別膠質瘤中常見突變基因的分布表示為總病例 (n)的百分比。來源TCGA。膠質瘤蛋白質組是使用TCGA轉錄組學數據和基于抗體的蛋白質數據構建的。它表明  895個基因在膠質瘤中表達升高，其中267個被認為具有預后意義。在預后基因中，200個與預后不良相關，67個與預后良好相關。 

對于不利基因，診斷時較高的相對表達水平會顯著降低患者的總體存活率。對于有利基因，診斷時較高的相對表達水平可顯著提高患者的總體生存率。圖7顯示了高級別(GBM)和低級別膠質瘤中突變基因的不同組成。

圖7.高級別和低級別膠質瘤的突變基因組成不同高級別(GBM)和低級別膠質瘤中常見突變基因的分布表示為總病例(n)的百分比。

與GBM不良預后顯著相關的前20個基因：

與GBM良好預后顯著相關的前20個基因：

膠質瘤腫瘤微環境
腫瘤細胞與周圍腫瘤微環境（TME）之間的動態相互作用在膠質瘤的持續生長、增殖和侵襲、存活、逃避細胞死亡、代謝、遷移和轉移等過程中發揮著至關重要的作用。 

膠質瘤TME具有高度異質性，由多種癌細胞和非癌細胞組成，包括內皮細胞(EC)、免疫細胞、膠質瘤干細胞(GSC)和星形膠質細胞，以及非細胞成分，例如作為細胞外基質  (ECM)  (Boyd  2021;  Yekula  2020)。已經記錄了神經膠質瘤腫瘤細胞和 TME之間的幾種細胞間通訊方式。在膠質瘤  TME  中，細胞通過內皮細胞、生長因子、細胞因子、趨化因子、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、小膠質細胞、T 細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞和癌癥干細胞進行交流（Cole  2020；Radin 2020）。

圖8.了解動態神經膠質瘤腫瘤微環境對于開發新的免疫治療策略是必要的。

膠質瘤細胞與正常的非腫瘤細胞共存。膠質瘤細胞在缺氧免疫抑制TME中增殖，血管系統異常，細胞外基質豐富而特別，血腦腫瘤屏障受損。TME中的四種機制對于我們了解神經膠質瘤至關重要，對于開發新的治療策略（如免疫調節、血管生成、癌癥干細胞和耐藥性）至關重要。許多這些機制是相互依賴的，并帶有特定的分子特征。 

免疫調節
近年來，免疫療法已成為抗癌治療的主要選擇之一。然而，膠質瘤免疫原性和微環境相互作用的復雜機制僅得到部分闡明（Desland  2020）。腫瘤細胞抑制局部和全身免疫反應并劫持與TME交流的能力嚴重限制了治療效果。

免疫細胞是膠質瘤TME的重要組成部分，因為它們可以達到高達50%的腫瘤質量含量。膠質瘤中的免疫細胞開啟TME中的炎癥過程，從而促進腫瘤發展（Gieryng  2017；Strepkos  2020）。同時，高級別膠質瘤比低級別膠質瘤具有更多的免疫抑制特征。

在免疫相關基因  ADORA2A中，CD160、CD276、NRP1和VTCN1在低級別膠質瘤中顯著過表達。在高級別膠質瘤中，VTCN1、BTNL2和METTL21B過表達，而CD86、HAVCR2、LAIR1和VSIR的表達顯著降低。

神經膠質瘤細胞分泌的細胞因子和趨化因子誘導免疫抑制細胞（MDSCs、Tregs和TAMs）的浸潤和骨髓細胞獲得促腫瘤表型（M2 表型分化和PDL-1和B7表達）。 

血管生成
膠質母細胞瘤預后不良的部分原因是藥物無法成功通過血腦腫瘤屏障。膠質母細胞瘤是高度血管化的腫瘤，膠質瘤的生長依賴于新血管的形成。血管生成是一個復雜的過程，涉及血管內皮細胞在特定信號的刺激下增殖、遷移和分化。

例如，高級別膠質瘤的高代謝需求會產生缺氧區域，從而觸發PLVAP（血腦屏障破壞的血管標志物）和血管生成的表達，導致異常血管的形成和功能失調的血腦腫瘤屏障。與瘤周正常組織相比，未成熟血管的標記物 Endoglin(CD105)在膠質母細胞瘤中的含量顯著高于正常組織。 

膠質瘤癌癥干細胞和耐藥性
化療耐藥和復發是膠質瘤患者管理中的主要問題，也是導致死亡的主要原因。膠質瘤的復發在很大程度上與腫瘤細胞在初始治療后從原發腫瘤內和周圍的抗治療癌癥干細胞再生的能力有關。膠質瘤癌干細胞(GSC)是高級膠質瘤中不受控制的細胞生長的主要驅動力，也是對治療的抵抗力。

GSCs通過一組核心的神經發育轉錄因子和癌基因發揮作用。高級別膠質瘤顯示干細胞轉錄升高，例如  ALDH1A1、EZH2、GFAP、SALL4、NANOG和POSTN。CD133、CD44、A2B5、CD15、CD171等分子表面標志物也與膠質瘤的復發和膠質母細胞瘤的侵襲性增加有關。

最后，給大家介紹幾個在不同級別的膠質瘤中對相關TME標志物的研究：

1.Chi3l1
人類腫瘤的表型可塑性可以通過激活上皮-間質轉化(EMT)過程來驅動，細胞通過該過程獲得可塑性并獲得干細胞的特性。

CHI3L1是一種分泌蛋白，作為干細胞狀態的調節劑，在膠質瘤中高度表達。膠質母細胞瘤是高度血管化的腫瘤，膠質瘤的生長依賴于新血管的形成。CHI3L1 被用作膠質母細胞瘤侵襲、遷移和血管生成的標志物。

圖9.用單克隆抗 anti-CHI3L1 (AMAb91777)染色的人類正常皮層（左）和星形細胞瘤（右）。樣本的熒光免疫組織化學圖像顯示星形細胞瘤（綠色）中有強 蛋白表達。細胞核由 DAPI 復染（藍色）。

2.METTL21B
TME，包括小膠質細胞和巨噬細胞等骨髓細胞的浸潤，在膠質瘤進展中發揮著重要作用。膠質瘤積累的小膠質細胞/巨噬細胞是具有促腫瘤和抗腫瘤特性的混合細胞群，將抗原呈遞給CD4陽性T細胞的小膠質細胞表達屬于HLA II 類蛋白的HLADRA蛋白。膠質母細胞瘤患者的HLA表達增加，有證據表明HLA家族可用作治療膠質母細胞瘤的特定分子靶標。

METTL21B參與細胞粘附、血管生成和細胞增殖。其表達與蛋白質水平的膠質瘤分級呈正相關。METTL21B通過介導巨噬細胞從M1到M2的極化和調節免疫檢查點的表達來促進腫瘤的免疫逃避并影響預后。盡管如此，METTL21B水平高的患者可能對免疫檢查點阻斷治療有更好的反應。由于其底物特異性，METTL21B是治療膠質瘤的有希望的靶點。

下圖顯示了與對照相比，膠質母細胞瘤腫瘤細胞中METTL21B 的高表達以及活化的小膠質細胞(HLA-DRA)的數量增加。 

圖10.使用anti-HLA-DRA單克隆AMAb91674（細胞質，綠色）和anti-METTL21B多克隆HAP043020（細胞核，紅色）抗體對人類正常皮質（左）和膠質母細胞瘤（右）樣本進行多重IHC-IF染色。箭頭表示活化的小膠質細胞（HLA-DRA陽性染色）。

3.SALL4
靶向GSCs是膠質瘤臨床治療的一個極其重要的方面。對膠質瘤GSC的更好理解為膠質瘤發生過程中細胞的動態交流提供了功能性見解，為診斷和治療創造了新的機會。

轉錄因子SALL4參與細胞增殖、凋亡、周期、侵襲、進化和耐藥性。SALL4在膠質瘤患者中過度表達，并與不良結果相關。SALL4通過加強PI3K/AKT信號通路（這是一種調節腫瘤發生的通路，在膠質瘤中顯著激活）發揮作用，從而降低腫瘤抑制因子PTEN的表達。 

圖11.SALL4在人和小鼠組織中的表征。使用anti-SALL4（AMAb91769）單克隆抗體進行免疫組織化學染色，顯示睪丸(A)、卵母細胞(B)和胚胎睪丸癌(C)人類組織中的生殖細胞中的核陽性，以及發育中大腦中的一部分細胞中的核陽性小鼠胚胎E11(D)。 

圖12. SALL4 在膠質瘤樣本中的表達變多。使用anti-SALL4（AMAb91769）單克隆抗體（核，紅色）對人正常皮質和膠質母細胞瘤樣本進行多重IHC-IF染色。和anti-PTEN 單克隆抗體（AMAb91736 ）（細胞質，綠色）。細胞核用DAPI（藍色）復染

4.EZH2/ALDH1A3/Shugoshin 2

轉錄因子EZH2在膠質瘤中高度表達，是免疫治療的潛在靶點。 EZH2是一種組蛋白H3賴氨酸甲基轉移酶，可通過改變腫瘤抑制基因的表達來促進包括神經膠質瘤在內的多種人類惡性腫瘤的腫瘤發生。膠質瘤中的EZH2過表達與幾個免疫檢查點、細胞周期、DNA復制、錯配修復、p53信號傳導和腫瘤浸潤淋巴細胞有關。 

醛脫氫酶ALDH1A3與細胞粘附和腫瘤侵襲相關，是膠質瘤Mes亞型的標志物。ALDH是與膠質瘤惡性表型相關的癌癥干細胞的標志物。在ALDH同種型中，ALDH1A3在高級別膠質瘤中比在低級別膠質瘤中過表達，而ALDH1A1在低級別中比在高級別膠質瘤中過表達。大多數  Mes亞型患者具有高ALDH1A3 mRNA表達，表明ALDH1A3是腦膠質瘤Mes亞型的有用標志物。 

Shugoshin 2在細胞分裂和細胞周期進程中至關重要。Shugoshin 2(SGO2)在膠質瘤細胞增殖中起關鍵作用。數據顯示，SGO2表達與WHO對人類神經膠質瘤的分級呈正相關。

圖13.使用anti-EZH2 (AMAb91752) （綠色，核）、anti-PARP1 (AMAb90959)（紅色，核）和anti-ALDH1A3 (AMAb91754)(藍色，細胞質)對人和膠質母細胞細瘤胞、星瘤形、少突膠質細胞瘤正常皮質樣本進行多重IHC-IF染色單克隆抗體。

圖14使用anti-EZH2(AMAb91750) （綠色，核）單克隆和anti-SGO2(HPA03516)對人正常皮質和膠質母細胞瘤樣本進行多重IHC-IF染色（品紅色，核）多克隆抗體。

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