IsoPlexis的單細胞蛋白組技術不僅可以“向外看”---檢測培養單個細胞胞外分泌的細胞因子；也可以“向內看”---檢測單細胞水平胞內蛋白。使用細胞內蛋白組學相關panel可以在幾天內揭示腫瘤靶向治療中信號通路變化。

在腫瘤治療耐藥性研究中，研究人員經常通過基因組研究來了解腫瘤的微環境和信號通路，但腫瘤中一些功能的適應性變化沒有引起基因層面的改變，所以僅憑基因組學研究很難提供腫瘤治療耐藥性機制的完整信息。單細胞胞內蛋白組解決方案是研究腫瘤信號通路和治療耐藥性基礎的關鍵工具，幫助研究人員進行完整的功能表征。

檢測胞內蛋白的區別

傳統檢測細胞內磷酸化蛋白方法之一是流式細胞術，進行表面抗體標記分型細胞再進行細胞固定破膜，讓熒光抗體進入細胞內標記胞內磷酸化蛋白。這聽起來不難，但實際有好幾個需要考慮的實驗步驟。

首先，固定破膜液的選擇會影響抗體標記的效果，還要兼顧表面標記不受胞內熒光抗體的影響。其次是抗體的挑選跟配色方案，不是所有經過驗證的抗體都可以不受固定破膜液的影響，標記到胞內磷酸化蛋白；抗體上帶的熒光染料也有可能被固定液破壞導致信號不足。如果一次想看好幾個胞內磷酸化蛋白，還要考慮抗體之間的特異性不跟其它蛋白交叉反應，以及熒光染料之間的熒光補償問題。倘若還要考慮表面蛋白標記分型的抗體，整個流式抗體配色方案就要思考設計一整天，更不用說實驗后還得根據數據結果優化整個方案了，幾次實驗下來花費的時間可能就是幾周了。總結以上幾點，一般流式檢測胞內磷酸化蛋白靶標只能是2-5種。

IsoPlexis單細胞胞內磷酸化蛋白質組解決方案針對每個芯片中500-1500個單個細胞，分析每個細胞多達15種磷酸化蛋白。經過反復驗證的抗體組合，通過這些信號通路中關鍵磷酸化蛋白的表征研究細胞信號通路，研究整個信號網絡的變化，并揭示關鍵的適應性耐藥途徑。IsoPlexis系統還是全自動化運行的，單細胞懸液樣本加入微流控芯片后，細胞在芯片中進入單細胞微室、裂解單細胞，微室為磷酸化蛋白檢測提供了一個更大的捕獲區域（圖1），單細胞的分離、裂解，以及細胞內蛋白的檢測都由儀器自行完成。
 

圖1：以流式為基礎的傳統方法與單細胞胞內蛋白組技術對比
 

需要特別指出的是流式配色panel設計是一個非常復雜的過程。使用IsoPlexis單細胞檢測系統避免了復雜流式配色panel的設計，系統使用條形碼抗體，避免了檢測過程中不同蛋白之間的相互干擾。IsoPlexis進行了相關的方法開發，配套的芯片panel已被驗證和優化，適用于不同的應用方向（圖2），不需要研究人員進行優化，可立即使用 。這意味著研究人員不需要耗費可能長達數個月的時間去建立方法，開發panel，再進行實驗；只需要幾天內就可以得到結果。

圖2：經過驗證的panel

應用案例之一：在腫瘤靶向治療的過程中，一旦對治療產生耐藥性，腫瘤就會復發，必須開發更好的治療方案。治療耐藥性的表征對于創建有效治療方案至關重要；因為腫瘤細胞存在異質性，定義和測量每個腫瘤細胞對信號通路的貢獻至關重要。通過同時對不同信號通路中關鍵節點的多達15個磷酸化蛋白進行檢測，可以幫助分析多重蛋白之間關聯性，評估信號通路是否被抑制，或者新的信號通路是否建立，進一步得到完整的信號通路網絡信息，評估治療方案的耐藥性，以確定有效的靶點（圖3）。

另一篇應用在Cancer Cell的一篇文章中：利用IsoPlexis的單細胞胞內蛋白組技術，研究人員能夠通過分析信號通路中不同磷酸化蛋白的協同關系評估膠質細胞瘤治療耐藥性的產生。研究表明，耐藥性可以通過一種非遺傳（適應性）機制進行，該機制在單一抑制劑用藥后的幾天內被激活（圖3）。
 

圖3：用藥后，胞內信號通路的改變

單一藥物治療后，測量到腫瘤胞內功能的適應性變化提示研究者進行聯合治療，即同時使用多種靶向藥物進行治療，應對單一藥物治療帶來的耐藥性問題。結果顯示多藥聯用可以有效阻止腫瘤生長（圖4）。這種單細胞分析方法為設計更有效的腫瘤聯合治療策略提供了可能。
 

圖4：多種藥物聯用，評估有效治療方案

IsoPlexis單細胞蛋白質組檢測技術相比傳統方法省去了流式實驗方案設計，全自動儀器節省了實驗人力物力，更重要的是節省寶貴的樣本，使用單細胞胞內磷酸化蛋白質組芯片針對15種磷酸化蛋白捕獲相對完整的信號通路網絡信息。另外還有單細胞分泌蛋白質組及多重細胞因子蛋白質組芯片，3款芯片聯用可以更地了解免疫細胞對不同治療方案的功能性反應。
 

文章來源：IsoPlexis