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辣根過氧化酶使試劑中的發光物（luminol）氧化并發光，而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中，將復雜的蛋白混合物經sds-page分離，并轉移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用于免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。
原理
辣根過氧化酶使試劑中的發光物（luminol）氧化并發光，而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中，將復雜的蛋白混合物經sds-page分離，并轉移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用于免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。當加入免疫印跡化學發光試劑后，luminol發生氧化降解，并發射波長為428nm的光，此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。
用途
非放射性發光系統，用于檢測固定在膜上的蛋白，其敏感性達1-5pg。用x光片可快速地獲得永.久的硬拷貝結果。所含獨.特的底物足以維持12小時以上的發光，便于反復曝光操作，免疫印跡膜經抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測。
使用方法
1. 印跡膜制備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作，適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對于降低背景非常重要，在與HRP交聯物溫育后，膜片更需仔細洗滌，所有步驟均在室溫下完成。
2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液，混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
3.蛋白信號顯現
1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。
2). 置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。
3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。
4). 于暗室中壓上x光片。
5).根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果。顯影沖洗。
6). 調節曝光時間，再次曝光顯影。
4、膜的重復使用：
配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫，最后用bsa（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。
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