導讀

細菌耐藥性的出現嚴重威脅到全球人類和動物的健康，研究細菌耐藥性是微生物研究的重點領域。近年來，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF）已成為微生物鑒定的常規技術，但其在微生物耐藥性研究中的應用尚處于起步階段。替加環素是一種新型四環素類抗生素，被世界衛生組織列為治療臨床多重耐藥菌感染極其重要的抗菌藥物，被認為是治療產碳青霉烯酶多重耐藥腸桿菌感染的“最后一道防線”。然而，質粒介導的新型高水平替加環素耐藥基因Tet(X3/X4)的出現，威脅到替加環素在臨床多重耐藥菌感染中的療效，但其潛在機制尚不清楚。使用MALDI-TOF快速地對替加環素耐藥基因Tet(X)不同突變體的單加氧產物進行定性分析的方法，大大地拓展了MALDI-TOF在細菌耐藥性檢測中的應用。

細菌耐藥性的出現威脅抗生素的療效

近期，華南農業大學獸醫學院孫堅教授團隊在微生物領域知名刊物《mSystems》上發表題為《Evolutionary Trajectory of the Tet(X) Family: Critical Residue Changes towards High-Level Tigecycline Resistance》的研究成果。該研究探索了導致Tet(X)功能增強的關鍵氨基酸變化，并據此闡明了Tet(X)的結構特征和進化路徑。通過結構域互換和位點定向突變實驗，成功識別了5個導致Tet(X)活性增強的殘基突變(L282S、A339T、D340N、V350I和K351E)。結構分析表明突變殘基不直接參與底物結合或催化，而是通過間接改變構象動力學影響酶的活性。該研究擴展了對Tet(X)同系物的結構特征和功能演變的認識，為后續特異性抑制劑的篩選和新型四環素類抗生素的開發提供了依據。

mSystems，May/June 2021 Volume 6 Issue 3 e00050-21

MALDI-TOF/TOF對不同Tet(X)突變體進行功能驗證

在BL21(DE3)-pET28大腸埃希菌表達系統中引入Tet(X2)、Tet(X4)和3個定點誘變突變體（L282S、A339T-D340N和V350l-K351E）。將體外純化后的蛋白（酶）依次加入含Mg2+和NADPH的伊拉瓦環素緩沖液中，反應15分鐘后，用質譜法檢測藥物的單加氧產物峰（圖1）。取1 μL的上清溶液點到靶板上，待干燥后，覆蓋1 μL CHCA（ α-氰基-4-羥基肉桂酸）基質溶液，待自然干燥后，將靶板送入質譜分析（島津AXIMA-Performance）。

圖1. AXIMA Performance – MALDI TOF/TOF上機流程圖

結果顯示，在反應15分鐘后，所有突變體在m/z 574處都出現了額外的峰，與伊拉瓦環素分子量增加16Da后的單加氧產物的分子量相對應（圖2)。結合紫外全波長掃描結果，證明了這幾個位點的氨基酸變化僅增加酶的活性而未改變Tet(X)的單加氧特性。

圖2. 不同Tet(X)突變體的功能驗證

(a) Tet(X)降解伊拉瓦環素的模型圖 (b)基于MALDI-TOF的單加氧產物的質譜測定

AXIMA Performance – MALDI-TOF/TOF 質譜儀

AXIMA Performance 作為島津功能強大的科學研究級MALDI-TOF/TOF儀器，可用于常規分子量檢測、微生物的快速鑒定、聚合物分析。還可以多方位的開展高通量蛋白質組學研究，包括多肽、蛋白分子量測定，蛋白鑒定，多肽序列分析，翻譯后修飾研究，如磷酸化，糖基化研究等。高通量自動化蛋白鑒定，高分辨雙離子門，高能CID技術進行MS/MS，新型曲線場反射器等前沿技術使該儀器成為蛋白質組學研究的有力工具。

圖3. 島津AXIMA-Performance質譜儀

l 真正的高能MS/MS—實驗室參考系的碰撞能量為20keV的CID。

l 采用革新的離子門技術達到理想的母離子選擇分辨率。

l 出色的靈敏度-無損失技術保證無MS/MS信號丟失。

專家心聲

華南農業大學獸醫學院孫堅教授在開展細菌耐藥性相關的課題研究中，常使用島津MALDI-TOF質譜儀進行樣品檢測。孫老師表示，在細菌耐藥性研究過程中，島津公司生產的AXIMA Performance質譜儀能夠幫助他們快速地對不同Tet(X)突變體的單加氧產物進行定性分析，該儀器具備操作簡單，高通量和準確性高等優點，為該團隊的研究提供了有力的幫助，提高了研究效率。

華南農業大學獸醫學院孫堅教授

參考文獻

1.Cui C-Y, He Q, Jia Q-L, et al. 2021. Evolutionary trajectory of the Tet(X) family: critical residue changes towards high-level tigecycline resistance. mSystems 6:e00050-21. https://doi.org/10.1128/mSystems.00050-21.

2.Cui Z-H, Zheng Z-J, Tang T, et al. (2020) Rapid Detection of High-Level Tigecycline Resistance in Tet(X)-Producing Escherichia coli and Acinetobacter spp. Based on MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:583341. doi: 10.3389/fcimb.2020.583341.

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