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凝膠過濾填料的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，后出柱。自GE的葡聚糖凝膠G25問世以來，到現在已經有65年的歷史，G系列的填料也是古老和經典的凝膠排阻系列填料，這種填料大的缺點就是不耐壓（尤其是G-100和G-200，流體靜力壓要求非常低）和分辨率差，G25填料一般用于透析和較低分子量多糖或蛋白分離，一般情況G25填料溶脹需要16-24h，溶脹好后的填料從色譜柱側面看有一種多糖*的乳光。
凝膠過濾填料層析原理：
凝膠過濾：依賴于分子的大小和形狀。
吸附層析：依賴于被分離化合物與凝膠之間的氫鍵數量和質量。
分配層析：依賴于分離化合物在流動相（溶劑）和固定相（凝膠）之間的分配，這主要由樣品的極性和溶劑的極性決定的。
凝膠過濾填料可應用于膽固醇、脂肪酸、激素、維他命、天然產物的分析。Sephadex LH-20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。
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