今天我們向大家介紹一種測(cè)量清醒狀態(tài)下的小鼠腦血流檢測(cè)方法，文章中作者通過(guò)光學(xué)相干斷層成像（OCTA）和內(nèi)在光學(xué)信號(hào)成像（IOSI）檢測(cè)*清醒小鼠的腦血流和血流動(dòng)力學(xué)。文章中詳細(xì)介紹了顱骨窗的準(zhǔn)備過(guò)程，并對(duì)清醒的小鼠腦部血流進(jìn)行穩(wěn)定的光學(xué)記錄，以及實(shí)現(xiàn)多參數(shù)血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量的成像方法。結(jié)果表明，通過(guò)使用OCTA技術(shù)，可以在動(dòng)物*清醒狀態(tài)下可靠地繪制出高分辨率的腦血管系統(tǒng)，包括穿透性小動(dòng)脈和毛細(xì)血管床的流速測(cè)量。最后，文章展示了在小鼠清醒狀態(tài)下施加觸須刺激時(shí)小鼠腦部皮質(zhì)層的血流動(dòng)力學(xué)改變。相信這里介紹的這種方法將有助于記錄在清醒正常狀態(tài)下的動(dòng)物模型的真實(shí)血流動(dòng)力學(xué)改變，這為許多新的研究方向打開(kāi)了全新的視野，并可以將將神經(jīng)刺激與微循環(huán)的改變進(jìn)行更緊密的聯(lián)系和研究。

  顱窗的建立和檢測(cè)設(shè)備的搭建
  首先作者在第0天通過(guò)異氟醚全麻對(duì)小鼠進(jìn)行顱骨窗手術(shù)，然后在動(dòng)物房進(jìn)行手術(shù)恢復(fù)7天。在恢復(fù)期內(nèi)，除了基本的術(shù)后監(jiān)護(hù)和顱窗數(shù)碼攝影外，沒(méi)有進(jìn)行任何影像學(xué)和訓(xùn)練。從第8天開(kāi)始，每天將小鼠帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行至少連續(xù)4天的處理和訓(xùn)練，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、實(shí)驗(yàn)者和頭部約束裝置，老鼠在頭部約束成像之前接受了額外的訓(xùn)練（詳細(xì)見(jiàn)原文鏈接）。在研究的第12天開(kāi)始進(jìn)行第一次清醒成像，使用IOSI和OCTA進(jìn)行頭部約束成像所需的最長(zhǎng)時(shí)間為40分鐘。為了進(jìn)行演示，我們?cè)诶鲜笊砩蠄?zhí)行了IOSI和所有三種OCTA協(xié)議，但是可以根據(jù)未來(lái)研究的目的選擇性地執(zhí)行這些協(xié)議。如果操作和訓(xùn)練良好，老鼠可以每天成像，長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)的最后一天，老鼠被麻醉成像然后anlesi，或者在麻醉下直接anlesi。





  圖一：A） 實(shí)驗(yàn)時(shí)間線(xiàn)。B） 安裝顱骨窗的腦部顯微鏡圖像。C） 開(kāi)顱手術(shù)的橫斷面解剖。D） 安裝固定裝置和顱窗后的顯微鏡圖像。E） 顱骨植入物的示意圖和尺寸。F） 從第0天到第14天顱骨窗的一系列顯微鏡圖像。G） ，H）和I）頭部約束裝置的3步操作/培訓(xùn)。

 在使用OCTA采集腦部血流信號(hào)的過(guò)程中，使用內(nèi)部構(gòu)建的雙模光學(xué)成像平臺(tái)。OCTA在小鼠腦組織中達(dá)到～5.1µm的軸向分辨率和～10µm的橫向分辨率。并為樣品提供2.22?mm的成像深度。下圖為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中示意圖。



  圖二：A）光學(xué)成像系統(tǒng)的示意圖。SLD：超發(fā)光二極管，PC：偏振控制器，PC（bold）：個(gè)人計(jì)算機(jī)。B）鼠標(biāo)觸須刺激設(shè)置的示意圖。C）和E）使用OCTA成像。D）和F）使用IOSI進(jìn)行成像。
  OCTA技術(shù)在清醒小鼠腦血流顯像中的應(yīng)用
  在建立顱窗模型后第14天，作者使用OCTA掃描成像在清醒小鼠中獲得了高分辨率的血管系統(tǒng)圖像和血流灌注動(dòng)力學(xué)圖像。下圖中的所有結(jié)果都是在清醒的小鼠處于靜息狀態(tài)（無(wú)刺激）時(shí)獲得的。結(jié)果顯示了小鼠腦部的三維血管系統(tǒng)的血管圖像并獲得了此范圍內(nèi)的斷層圖像，通過(guò)這些圖像作者發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)層上方生長(zhǎng)著一層血管豐富的腦膜組織，這在之前的急性顱骨窗中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。因此為了增強(qiáng)皮質(zhì)血管系統(tǒng)的可視化，作者使用半自動(dòng)分割軟件將顱窗下的腦組織分離成腦膜層（L1）和皮質(zhì)層（L2），如圖3（C）中的黃色分割線(xiàn)所示。在去除L1中的尾隨偽影后，生成新的正面投影圖像圖3（L2）。與圖3（A）中的原始投影圖像相比，L2的皮質(zhì)血管系統(tǒng)可以得到更好的成像效果和對(duì)比度。之后作者又通過(guò)DOCTA對(duì)顱窗進(jìn)行成像并進(jìn)行血流檢測(cè)，結(jié)果顯示穿透小動(dòng)脈（綠色）和上升小靜脈（紅色）的雙向軸向速度，速度范圍為6.1?mm/s至-6.1?mm/s如圖3（D）。為了更準(zhǔn)確地評(píng)估毛細(xì)管動(dòng)力學(xué)，作者將直徑大于15µm的較大血管進(jìn)行掩蔽來(lái)去除信號(hào)。進(jìn)一步處理的速度圖如圖3（F）所示。圖3（G）和圖3（H）中的橫截面展示了掩蔽大流量信號(hào)前后的差異。
 

 圖三：A） 顱窗手術(shù)后第14天清醒小鼠靜息狀態(tài)下全深度3D-OCTA數(shù)據(jù)集的EN-FACE面最大強(qiáng)度投影（MIP）。B） OCTA斷層結(jié)構(gòu)在圖A中紅色虛線(xiàn)位置的橫截面。C）帶有L1和L2黃色分割線(xiàn)的OCTA血流橫截面。右側(cè)顯示了兩個(gè)分割層的EN-FACE面圖像。D） 利用三維DOCTA數(shù)據(jù)集的MIP生成雙向軸向速度圖。彩色條代表紅細(xì)胞在±6.1?mm/s范圍內(nèi)從皮質(zhì)表面下降（正，綠色）和上升（負(fù)，紅色）的血流軸向速度。E） 和F）顯示了300µm厚平面內(nèi)3D毛細(xì)管速度測(cè)量數(shù)據(jù)集的平均強(qiáng)度投影（AIP），分別對(duì)應(yīng)于它們的橫截面G）和H）。此圖中的所有比例尺代表500µm。
  清醒小鼠觸須刺激的血流動(dòng)力學(xué)研究
  接著作者使用IOSI揭示了清醒狀態(tài)下小鼠桶狀皮質(zhì)神經(jīng)活動(dòng)引起的血流動(dòng)力學(xué)變化。圖4(A)上圖顯示了尚未觸須刺激時(shí)，圖像采集時(shí)的相對(duì)反射率（-ΔR/R）。下圖顯示圖像采集15秒時(shí)的-ΔR/R圖（觸須刺激5秒）。結(jié)果顯示通過(guò)刺激引起的血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)被觀(guān)察到血管與背景的對(duì)比度更高，相應(yīng)地，由于激活，桶皮質(zhì)的總血紅蛋白（充血）局部增加。在IOSI結(jié)果的指導(dǎo)下，在桶皮質(zhì)（R1）和對(duì)照區(qū)（R2）進(jìn)行了八次毛細(xì)管速度掃描。圖4（B）-（E）顯示了這兩個(gè)區(qū)域在不同狀態(tài)下的毛細(xì)管速度圖。繪制了速度信號(hào)的直方圖分布圖，以比較與休息和刺激的差異。在R1中，如圖（D）所示，RBC速度在統(tǒng)計(jì)上增加，使得刺激狀態(tài)的分布稍微向右傾斜。這也符合圖4（C）中的觀(guān)察結(jié)果，其中一些速度信號(hào)在觸須刺激期間被增強(qiáng)。相反，對(duì)照區(qū)（R2）的兩個(gè)分布大部分是重疊的圖4（G），刺激后沒(méi)有觀(guān)察到分布位移。
 


 圖四：A） IOSI刺激小鼠觸須過(guò)程中桶狀皮質(zhì)的寬場(chǎng)反射圖。上圖：2秒數(shù)據(jù)采集（無(wú)刺激）。下圖：15秒數(shù)據(jù)采集（5秒觸須刺激）。R1表示觸須刺激時(shí)血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)激活，R2為未觀(guān)察到反應(yīng)的對(duì)照區(qū)。比例尺代表1?mm。B） -E）是不同狀態(tài)下兩個(gè)區(qū)域的三維測(cè)速數(shù)據(jù)集的EN-FACE面AIP圖像。在遮蓋大血管后，在300µm厚的平面內(nèi)生成圖像，剩余的毛細(xì)管速度信號(hào)用F（R1）和G（R2）的直方圖分布繪制。分布直方圖中的插圖表示從刺激到休息的減法。比例尺為200µm。

  好了，文章讀到這里不知道大家有什么新的想法呢。小編覺(jué)得本文介紹的方法對(duì)清醒小鼠腦血流的光學(xué)成像具有很大指導(dǎo)意義，有望為清醒行為動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)開(kāi)辟新的視野，以進(jìn)行腦功能和藥物開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)研究。今天就到這里吧，歡迎有對(duì)OCTA技術(shù)感興趣的老師們找我進(jìn)行溝通咨詢(xún)，讓我們一起探索這奇妙的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)吧!
  參考文獻(xiàn)Li Y, Rakymzhan A, Tang P, Wang RK. Procedure and protocols for optical imaging of cerebral blood flow and hemodynamics in awake mice. Biomed Opt Express. 2020;11(6):3288-3300. Published 2020 May 26. doi:10.1364/BOE.394649