腫瘤治療過程中，對治療反應的預測可能對治療選擇和優化其遞送參數中起到關鍵作用。來自俄羅斯和加拿大的研究人員M. A. sirotkina等將光學相干血管造影術（OCA）作為成像方法，使用小鼠耳移植腫瘤模型（CT-26）進行了臨床前試驗，觀察正常和病理灌注血管，并監測了血管經靶向光動力療法（PDT）后的治療反應。還提出了一種穩定簡單的以微血管作為度量的方法，即PDT后t = 24h，腫瘤和腫瘤周圍區域的灌注血管密度（PVD），用以判斷PDT的成功。同時經組織學驗證，進一步證實了OCA微血管度量的出色早期預測能力，以及腫瘤周圍微血管在決定長期PDT反應中的關鍵作用。

  背景

 光動力療法（photodynamic therapy, PDT）是光照治療的一種，它憑借創傷小、毒副作用小、選擇性好、可重復性好、可保護容貌及重要器官功能等優點，日漸成為一種頗具前景的腫瘤治療手段，尤其是小實體腫瘤。光動力療法的作用機制是光敏劑分子被光活化，在良好的組織血液供應和氧合條件下形成單線態氧及其他活性氧類物質，導致腫瘤細胞壞死和凋亡。其中，光敏劑在癌癥區域的吸收、激發光的3D空間分布、以及受照射組織中的氧張力都會影響PDT治療效率，因此需要對這三個因素進行適當控制以確保治療效果。但臨床條件下，這些參數隨時空變化顯著，很難控制，從而也很難預測PDT在個體中的療效。

 鑒于此，研究人員提出了各種治療計劃、劑量測定、監測和反饋策略來優化和改善PTD的效果。已經有研究通過單線態氧發光或光敏劑光漂白檢測來測定PDT劑量，單線態氧發光法高靈敏度且可以直接檢測，但由于技術復雜及自身局限性導致無法在臨床得到廣泛應用。而基于光敏劑光漂白的劑量測定法得到的結果，似乎與長期臨床結果聯系不大。

 已知微血管系統是組織供氧的手段，也是光動力療法的潛在靶點，因此血管造影成像可能為監測PDT反應提供一種途徑。光學相干斷層掃描（OCT）具有出色的3D空間分辨率、成像速度快且無創，能以多種無造影方式檢測血液微循環。已經開發的各種OCT血管成像方法包括Doppler OCT, speckle variance OCT和phase variance OCT，在微血管探測率、對大塊組織運動穩定性、血管陰影偽影、血流檢測與微血管網絡可視化等方面都有相應的優缺點。本研究采用光學相干血管造影術（optical coherence angiography, OCA）能夠對流動血液灌注的活躍微血管進行靈敏3D檢測，提供顯微結構和功能性微循環圖像，這對于監測PDT過程中的灌注情況非常重要。結合臨床前和臨床研究，證明用OCA對血液灌注反應監測，可在抗腫瘤治療監測和結果評估中發揮潛在用途。

 已知在治療期間和/或治療后不久（約幾小時），監測腫瘤血管的損傷情況，可能會幫助預測出腫瘤對PDT的最終反應。在之前的耳腫瘤模型研究中，研究人員得出了一個簡單方便的判斷PDT有效性的標準，即PDT后24小時，OCA圖像上沒有灌注血管。但由于數據量較少（n = 11）且標準過于簡單，造成有20%的假陽性率，此外也沒有研究PDT對腫瘤周圍微血管的損害。事實上，如果PDT沒有如期破壞掉腫瘤周圍組織中起供應作用的脈管系統，腫瘤就沒有被治愈，并可能復發，因此有必要在大量樣本中，對腫瘤和腫瘤周圍血液灌注中的PDT效應進行更全面的研究。

 研究人員在接種了CT-26鼠結腸腫瘤細胞系的臨床前小鼠耳模型（n = 31）中，使用OCA對PDT治療情況進行了監測。有意選擇“溫和”的PDT照射方案，以獲得有反應者和無反應者的一系列結果。根據PDT后幾個時間點（0-24h）OCA對腫瘤及腫瘤周圍組織的監測，來預測治療結果，并將預測結果與治療后7天組織學顯示的治療結果相關聯。結果發現從t = 24h的OCA圖像得出的微血管指標，能夠準確區分出有無應答。

  結果

 基于OCA的PDT結果評估所用的可控腫瘤模型

 對比正常組織和腫瘤組織的OCA圖像，血管結構存在顯著差異。腫瘤脈管系統中由于活躍的新血管形成和血管發生，比腫瘤周圍組織脈管系統更密集，且扭曲度更高（圖1a，b）。

圖1 用于OCA觀察的小鼠耳模型中，灌注的微血管網絡結構。（a）3D OCA數據的2D投影，為正常耳朵微循環；（b）在小鼠耳朵中生長的CT-26腫瘤的OCA圖像（腫瘤細胞接種后兩周）；（c，d）小鼠耳朵的照片。黑色虛線為OCA成像區域，2.5 × 2.5 mm²。
 

 01-腫瘤及腫瘤周圍PDT效果的OCA可視化

 圖2a為PDT前，腫瘤及腫瘤周圍灌注微血管的OCA成像。在PDT后幾個時間點（即刻、t = 5h、t = 24h）進行OCA成像，并在t = 24h檢測到腫瘤及腫瘤周圍組織中發生zuimingxian的血管反應。圖2b表明腫瘤部位無灌注血管，且腫瘤周圍組織中灌注血管密度（PVD）非常低，二者同時出現可能表明PDT治療成功，即有應答。此外有些動物腫瘤本身中沒有灌注血管，但是腫瘤周圍組織中可見的一些有活力的灌注血管（圖2c），隨后證明是無應答。
 

圖2 PDT后t = 24h腫瘤及腫瘤周圍，灌注微血管的OCA圖像。（a）PDT前。（b）有應答的OCA實例：腫瘤內無可見灌注血管，腫瘤周圍組織PVD極低。（c）無應答的OCA實例：腫瘤內無灌注血管，但腫瘤周圍組織有許多灌注血管。虛線處為腫瘤邊界。

  02-對OCA圖像量化以用于PDT結果預測

 對獲得的3D微血管灌注圖譜進行量化和分析，以獲得用以準確預測PDT結果的OCA源標志物。首先檢查PDT前的數據，在31個樣本中，根據PDT前的腫瘤PVD可產生20個正確預測結果（準確率70%，威爾遜區間=48-75%）。根據腫瘤周圍組織PVD可產生18個正確預測結果（準確率58%，威爾遜區間=42-74%）。因此，PDT治療前的微血管灌注狀態似乎不能用于可靠預測PDT反應。當加入PDT后的數據，OCA預測精度提高了（圖3c）。統計了PDT后三個時間點（即刻、t = 5h、t = 24h）的正確預測結果（CPO），總結在表1中。

 

圖3 治療后OCA衍生的PVD變化，用于預測PDT是否成功。（a）腫瘤中PVD隨時間變化情況。（b）腫瘤周圍組織中PVD隨時間變化情況。（c）PDT治療后，三個時間點中，基于PVD值的正確預測結果的百分比。



 

表1 在不同時間點，根據腫瘤及腫瘤周圍PVD得到的，正確預測結果（CPO行）、相應的置信區間（CI行）、用于區分有應答和無應答者的PVD值閾值（PVD閾值行）的匯總。

 根據數據可以得出幾個判斷，首先證實了研究人員之前的觀察結果，即只有無應答的腫瘤OCA圖像上有灌注血管（PDT后t = 24h）。因此，如果在腫瘤區域內觀察到有任何灌注血管，則認為PDT不成功（圖3a）。然而反過來，治療后腫瘤內的灌注血管并不都是缺失的，是否有灌注血管不能預測PDT的結果。本研究中13例無應答中有8例在PDT后t = 24h時腫瘤內沒有灌注血管。其次從表1中不斷增加的CPO可以看出，PDT后經過的時間越長，預測精度越高。

 檢查t = 24h的數據，可注意到在有應答樣本的腫瘤周圍組織中，PVD比PDT前下降了一個數量級（0.38±0.22 vs 3.14±0.57%）。相比之下，無應答樣本的PVD略有減少（2.21±0.86% vs 3.29±0.59%）（圖3b）。根據這些趨勢可得出治療結果預測標準的公式，閾值可設置為有應答組中最高PVD值和無應答組中zuidiPVD值之間的平均值，即本研究中閾值= 1%。使用該閾值根據t = 24h腫瘤周圍PVD的測量值，正確地預測了所有31例樣本的結果（準確性= 100%，威爾遜區間=89–100%）。

 綜上所述，可以根據PDT后t = 24h的OCA可視化結果制定一個簡單易行的預測方案，即如果腫瘤內的OCA圖像中有任何灌注血管，則認為PDT不成功；如果腫瘤內沒有發現灌注血管，則應額外評估約2 mm附近的周圍組織，如果該區域灌注血管的總密度在OCA圖像上不超過1%，則可認為PDT是成功的；偏離這個標準為無應答。圖解總結見圖4。



 

圖4 基于OCA的PDT成功評估方案的圖解總結，基于治療后t = 24h的腫瘤及腫瘤周圍微血管反應。
 03-組織學驗證

 所有OCA檢查過的動物在PDT后7天接受組織學評估驗證。研究人員根據之前的研究，將組織學上腫瘤總壞死率> 95%的劃分為有應答（圖5a），將腫瘤壞死率< 95%劃分為無應答（圖5d）。對于PDT有應答樣本，腫瘤周圍區域，包括距腫瘤邊緣約2 mm的“正常”耳組織，都顯示缺血，并在組織學上可以清楚地看到壞死（圖5b，c）。對于無應答樣本，PDT后7天，在腫瘤邊緣即約2 mm以外的腫瘤周圍組織都沒有損傷。有應答和無應答中均觀察到組織病理學可見的壞死受照射腫瘤組織，但部分可能是由于血管的血栓形成，這表明僅局部腫瘤反應不足以預測治療結果，腫瘤周圍微血管系統也發揮關鍵作用。事實上，在PDT成功樣本中，距病理邊緣約2 mm的腫瘤周圍組織OCA上無灌注血管（t = 24h），有組織壞死（t = 7天）。

 無處理和僅光照的對照實驗樣本在整個觀察期間，圖像上都顯示出發育良好的腫瘤血管網絡，在研究結束時顯示出80-100%的活腫瘤細胞。



 

圖5 PDT后t = 7天治療結果的組織學評估。左側為有應答。（a）腫瘤中心部分的總腫瘤壞死率（> 95%）。（b）距腫瘤邊緣約2 mm的“正常”耳組織（但仍在PDT治療范圍內）*壞死。右側為無應答。（c）部分腫瘤壞死（~75%）和活腫瘤區。（d）未受損的“正常”耳組織，距離腫瘤邊緣約2 mm（但仍在PDT治療范圍內）。


 總結
 本研究提出了一個準確早期（治療后24小時）預測PDT成功的標準：即在腫瘤邊界內的OCA圖像中不應有可見的灌注血管，并且在2 mm范圍內的腫瘤附近區域，灌注血管密度不應超過OCA圖像尺寸的1%。已有類似研究結果能與之匹配，如Kutsuyoshi等人證明了阻斷腫瘤及腫瘤周圍血液循環，在預防癌癥復發的臨床策略中具有很大的潛力。在未來的臨床應用中，OCA成像可用于監測腫瘤治療中PDT療效，以及時對治療方案進行修正。
 

參考文獻：

Sirotkina, M. A. , et al. "Accurate early prediction of tumour response to PDT using optical coherence angiography." Scientific Reports 9.1(2019).