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實時熒光定量PCR儀技術(shù)的原理：體外核酸擴增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸），Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火一引物延伸”過程至25-40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。簡單的說，PCR儀就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。
實時熒光定量PCR儀使用的基本步驟：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃（左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；
②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；
?、垡锏难由欤篋NA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。
實時熒光定量PCR儀重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。
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