幽門螺桿菌改良無血培養(yǎng)基的研制方法！

百歐博偉生物：在無血腦心浸液卵黃瓊脂培養(yǎng)基(BHI-EA)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，建立一新型快速、簡便的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)無血腦心浸液卵黃瓊脂培養(yǎng)基(BHI-EA)。應(yīng)用此改良培養(yǎng)基和含血腦心浸液培養(yǎng)基(BHIA)分別對82例胃粘膜標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，對兩者在Hp陽性培養(yǎng)率、分離時(shí)間及Hp純培養(yǎng)速度方面進(jìn)行比較。改良培養(yǎng)基分離Hp陽性率為70%(57/82)，腦心浸液血培養(yǎng)基陽性率為63%(52/82)。采用改良培養(yǎng)基分離Hp時(shí)間縮短近24 h，純培養(yǎng)時(shí)間縮短近12 h，且細(xì)菌各項(xiàng)檢測指標(biāo)典型。因此，改良培養(yǎng)基更適用于Hp的分離培養(yǎng)。

An improved medium without blood for Helicobacter pyloriWANG Yichao,GUO Gang,XIE Qinghua,ZOU Quanming(Department of Clinical Microbiology,Third Military Medical University,Chongqing 400038)Abstract Establish a rapid and easy medium without blood for Helicobacter pylori.Improve the components to the brain heart infussion-egg yolk agar medium without blood(BHI-EA).Through isolation and c*tion of the Helicobacter pylori from 82 stomach mucosas with the improved medium and brain heart infusion agar containing blood(BHIA)to compared the difference between this improved medium and BHIA on the positive rate of the stomach mucosas,isolation time and grow speed of pure c*tion.The rate of Helicobacter pylori positive with the improved mediums was 70%(57/82),but with the BHIA was 63%(52/82).The time for pure c*tion could shorten 12 h,isolation shorten 24 h.All the test indexes were typically.The improved medium is easier to isolate and culture Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori(幽門螺桿菌,Hp)是一種與人類消化道疾病密切相關(guān)的病原菌。其體外培養(yǎng)的方法較多，國內(nèi)多采用含血腦心浸液培養(yǎng)基。由于其操作的繁瑣及易污染性，近年來陸續(xù)有人采用無血培養(yǎng)基即卵黃培養(yǎng)基，但該培養(yǎng)基仍存在培養(yǎng)時(shí)間較長的缺點(diǎn)。針對此情況，我們在卵黃培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，使培養(yǎng)時(shí)間縮短，且細(xì)菌的各種生物學(xué)性狀均較典型。

一、材料及方法

1、培養(yǎng)基的制備

（1）含血腦心浸液培養(yǎng)基(BHIA) 取腦心浸液(BHI)45 ml加入蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸餾水 55 ml，調(diào)節(jié)pH值至7.6～7.8，加瓊脂粉1.5 g后高壓，再加入已滅菌綿羊血5 ml，10 g/dl葡萄糖5 ml和萬古霉素、磺胺增效劑(TMP)，使其最終濃度分別達(dá)到10 mg/L、5 mg/L、0.38 mg/L，倒平板備用。

（2）卵黃腦心浸液培養(yǎng)基(BHI-EA) 取新鮮雞蛋于75%酒精內(nèi)消毒10分鐘，以無菌手續(xù)將卵黃取出放入有玻璃珠的無菌生理鹽水中，使最終體積比為1∶1，搖勻備用。向45 ml牛腦心浸液中加入胰蛋白胨1 g，1 g/dl可溶性淀粉，NaCl 0.5 g、Na2HPO4 1.5 g、蒸餾水55 ml，調(diào)節(jié)pH值為7.6，加瓊脂粉1.5 g高壓，待溫度降至60°C時(shí)加入上述卵黃水30 ml，再加入20 g/dl無菌葡萄糖溶液3 ml及抗生素混懸液，使最終濃度分別為，萬古霉素10 mg/L，TMP 5 mg/L， 0.38 mg/L，倒平板待用。

2、Hp分離培養(yǎng) 

取82例我校附屬醫(yī)院消化科胃鏡室就診病人胃粘膜標(biāo)本，分別置玻璃勻漿器內(nèi)研磨后，取等量懸液均勻涂布于上述二種培養(yǎng)基上。將各接種平板置于密閉玻璃干燥器內(nèi)，用抽氣泵抽至負(fù)壓73 kPa后，灌入氣體使終濃度分別達(dá)到(5% O2、85% N2、10% CO2)，罐內(nèi)放一盛水小瓶，使?jié)穸龋?5%，37°C孵箱內(nèi)孵育1～4天，觀察Hp生長情況以及檢測生物學(xué)性狀。

3、Hp純培養(yǎng) 

取等量已分離純化的Hp菌液轉(zhuǎn)種到上述兩種培養(yǎng)基上，L型玻璃棒均勻涂布后培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，觀察長出肉眼可見菌落所需時(shí)間。

4、Hp鑒定 

生長出的菌株用革蘭染色鏡檢，PCR鑒定，另作脲酶、氧化酶、觸酶及動(dòng)力實(shí)驗(yàn)對其生物學(xué)性狀進(jìn)行檢測，步驟按常規(guī)法進(jìn)行。

二、結(jié)果

1、兩種培養(yǎng)基上胃標(biāo)本中Hp分離培養(yǎng)速度的比較標(biāo)本接種后，每24小時(shí)觀察一次，如出現(xiàn)可疑Hp菌落，則取菌涂片行革蘭染色鏡檢，并作脲酶、氧化酶、觸酶和PCR鑒定。如果形態(tài)染色典型，脲酶、氧化酶、觸酶及PCR陽性則確認(rèn)為標(biāo)本Hp分離陽性。用BHI-EA培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后陽性例數(shù)在總陽性例數(shù)中的比率為21%(12/57)，高于BHIA上24 h的陽性比率2%(1/52)，兩者相差顯著(P＜0.01)。培養(yǎng)48 h后BHI-EA上的陽性比率為88%(50/57)，也顯著高于BHIA上的陽性比率60%(31/52)，證明BHI-EA培養(yǎng)基能顯著縮短胃標(biāo)本中Hp的檢出時(shí)間。

2、兩種培養(yǎng)基上胃標(biāo)本Hp分離陽性率比較分別對82例不同胃病患者(胃癌9例，胃炎16例，胃潰瘍23例，十二脂腸潰瘍24例，其它胃疾病10例)胃粘膜標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)。結(jié)果在BHIA上陽性分離率為63%(52/82)，而在BHI-EA上陽性率為70%(57/82)。培養(yǎng)結(jié)果表明，BHIA與BHI-EA對不同消化道疾病患者胃粘膜的Hp分離陽性率基本一致，BHI-EA稍高于BHIA，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3、兩種培養(yǎng)基上Hp純培養(yǎng)生長速度的比較所有Hp分離株在此兩種培養(yǎng)基上均能順利生長，但生長速度明顯不同，分別取前述57例陽性標(biāo)本的分離菌株進(jìn)行純培養(yǎng)。在BHI-EA上12 h即有4株菌長出肉眼可見菌落，24 h內(nèi)陽性結(jié)果為41例，陽性率為72%(41/57)。而BHIA上12 h內(nèi)無明顯菌落出現(xiàn)，直到24 h才有8株菌株出現(xiàn)，陽性率僅為14%(8/57)，顯著低于BHI-EA組(P＜0.01)。

三、討論

最近幾年報(bào)道的針對Hp培養(yǎng)的無血培養(yǎng)基基本解決了應(yīng)用含血培養(yǎng)基易污染的問題。但其培養(yǎng)速度仍較慢，我們采用的改良無血培養(yǎng)基充分解決了這一問題，在此培養(yǎng)基中，我們加入了相當(dāng)于常規(guī)卵黃培養(yǎng)基中兩倍的卵黃量，同時(shí)加入適量的胰蛋白胨成份，充分滿足Hp生長營養(yǎng)需求，有效地刺激其生長，此外加入可溶性淀粉可吸附標(biāo)本中有毒物質(zhì)及Hp生長的代謝產(chǎn)物，保證Hp處于有利的生長環(huán)境。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，改良卵黃培養(yǎng)基能大大提高Hp的生長速度從而較大程度的節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間，而且各項(xiàng)生物學(xué)性狀均很典型，完滿足臨床診斷及Hp的研究所需，是一種實(shí)用的Hp培養(yǎng)方法。

幽門螺桿菌作為人胃內(nèi)定居菌，對營養(yǎng)成分、氣體條件等均有較嚴(yán)格的要求，使其在體外培養(yǎng)中受到很多因素的影響，因此培養(yǎng)基在制備過程中應(yīng)嚴(yán)格控制pH值和各種成份的含量，特別是抗生素濃度及葡萄糖的含量。此外，由于Hp生長需要一定濕度條件，故在培養(yǎng)基傾倒平板后，應(yīng)密封放4°C冰箱待用，放置時(shí)間不宜超過兩周，保證Hp在新鮮培養(yǎng)基中有一生長環(huán)境。另外，由于此培養(yǎng)基能有效的促進(jìn)Hp生長，故在培養(yǎng)過程中應(yīng)掌握好時(shí)間以防生長過度導(dǎo)致細(xì)菌球性變。

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