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熒光定量PCR在反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線包括3個階段：基線期，擴(kuò)增期和平臺期。
只有在熒光信號擴(kuò)增期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以可以在這個階段進(jìn)行定量分析。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在熒光定量PCR反應(yīng)的指數(shù)期，需要設(shè)定一定熒光信號的閾值，一般這個閾值是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本地信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3~15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
熒光定量PCR的理論依據(jù)是什么？
特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴(kuò)增過程越短，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的。理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2"其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù)n為擴(kuò)增次數(shù)；理論上PCR擴(kuò)增效率為100%，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不*，即每一次擴(kuò)增中，模板不是呈2的倍增長；實(shí)際應(yīng)為：Y=X（1+E）"，其中E代表擴(kuò)增效率：E=參與復(fù)制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個PCR擴(kuò)增過程中不是固定不變的。通常X在1~105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時，E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數(shù)形式增加，進(jìn)入平臺期。
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