質譜成像技術揭示板藍根中化學成分的空間分布

板藍根（Isatidis Radix）為十字花科菘藍屬植物菘藍（Isatis indigotica Fortune）的干燥根，具有清熱、解毒、涼血、利咽等功效。作為清熱解毒類的代表藥物，板藍根與廣泛用于各類感冒的預防和治療，在嚴重急性呼吸綜合征（SARS）、甲型H1N1流感等疾病的防治中發揮了積極作用。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）爆發以來，各版《診療方案》和“三藥三方”中也不乏板藍根的身影。板藍根的抗病毒抗炎藥效顯著，但化學成分復雜，質量評價難度較高，因而一直是國內外研究的熱點。

目前研究學者已經從板藍根中分離得到近400個化合物，綜合文獻報道主要可歸納為生物堿、含硫化合物、苯丙素、核苷、氨基酸、有機酸、酚、黃酮、蒽醌、萜、醇、醛、酮、腈、酯、糖、甾醇、肽、鞘脂等19大類。研究藥用植物化學成分的空間分布，有助于了解其形態學結構和功能。盡管板藍根的化學成分研究已經十分深入，但其分子空間分布鮮見報道。質譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）技術是近年新興的分子成像技術，通過直接測定樣品表面的離子信號獲得其空間分布信息，具有非靶向、無需標記和多成分同時檢測的優勢。與光學圖像采集技術結合后，既可觀察到高分辨率的形態圖像，又可對特定的分子進行鑒定和可視化分布分析，在生命科學領域顯示出巨大的應用前景。本文采用高分辨質譜成像技術對板藍根化學成分的空間分布進行分析。利用大氣壓基質輔助激光解吸電離-離子阱-飛行時間質譜（atmospheric pressure matrix assisted laser desorption combined with ion trap-time-of-flight mass spectrometry，AP-MALDI-IT-TOF/MS）掃描不同產地藥材橫切面，鑒定所含化合物，并觀察化合物空間分布模式和富集位置，結合偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）算法，對不同樣品進行分類。研究思路見圖1。

圖1 AP-MALDI-IT-TOF/MS成像技術揭示板藍根中化學成分的空間分布

1. iMScope TRIO 成像質譜顯微鏡測試條件

質譜成像技術在植物、動物、人體組織中的內源性成分和藥物代謝組分的可視化檢測方面發展迅猛，但在中藥分析領域的應用才剛開始起步，且多用于新鮮采集的原植物或中藥材。而真正用于市場流通和臨床應用的中藥材為干品，制備滿足MSI測試需要的切片比較困難，故相關研究鮮見報道。在制備板藍根干品冰凍切片時，其干燥、堅硬、易碎的結構帶來了極大的挑戰，故對冷凍切片的厚度、溫度，切片固定方式，基質種類和添加方式等進行了詳細的優化。板藍根藥材經明膠包裹冷凍后，先用雙面碳導電膠貼牢后，再用冰凍切片機切制40 μm的組織切片，分別噴涂2, 5-DHAP溶液和1, 5-DAN溶液作為正、負離子的基質。主要質譜條件如下：激光照射直徑：40 μm，像素間隔80 μm，掃描范圍：m/z 100-500，m/z 500-1000。

2. 板藍根中化合物的AP-MALDI-IT-TOF MSI可視化分布

根據離子的準確質荷比、同位素豐度比，與對照品和液質一、二級數據比對，并結合文獻檢索和數據庫搜查，初步鑒定了多個化合物類別118個質譜峰（見圖2）。成像質譜顯微鏡將光學顯微鏡和質譜儀的優勢整合，既可觀察到形態圖像，又可對分子進行鑒定和可視化分布分析，在軟件上可簡便且高精度地重疊觀察光學顯微鏡圖像與質譜分析圖像，詳細解析感興趣區域。本文采用AP-MALDI-IT-TOF MSI技術揭示了板藍根中化合物的空間分布， 圖3和 圖4展示了板藍根橫切面的木栓層、皮層、韌皮部、形成層、木質部及部分化合物在特定空間區域的分布。綜合分析，板藍根中化合物大多富集于營養儲存的組織韌皮部，與之相比，水分輸送組織木質部中集中分布的成分較少。

圖2 板藍根MALDI-IT-TOF MS成像化合物鑒別結果

圖3 板藍根橫切面光學圖 (a) 和oxindole (b)、3-[2'-(5'-hydroxymethyl) furyl]-1(2H)-isoquinolinone-7-O-β-D-glucoside (c)、coniferin (d)、guanine (e)、histidine (f)、 proline (g)、arginine (h)、cyclo(L-Phe-L-Tyr) (i)等成分正離子質譜成像圖

圖4 板藍根橫切面光學圖 (a) 和 isatindigoside F (b)、clemastanin B (c)、maleic acid (d)、malic acid (e)、citric acid (f)、sucrose (g)、isovitexin (h)、vanillin (i) 等成分負離子質譜成像圖

3. PLSR法區分不同產地板藍根藥材

將4個產地的各3批板藍根藥材分別劃分到4個組。以樣品橫切面的AP-MALIDI-IT-TOF MSI數據為Y值，組別為X值，在正、負離子模式和m/z 100-500、m/z 500-1000兩個掃描范圍內，分別建立PLSR回歸模型。由圖5可見，在4個模型中，樣品規格的預測值和實際值均呈現良好的相關關系，說明采用PLSR法可對不同產地的板藍根進行準確的區分。

圖5 MALDI-IT-TOF MS成像結合PLSR回歸區分不同產地板藍根樣品

正離子m/z 100-500范圍 (A)、負離子m/z 100-500范圍 (B)、正離子m/z 500-1000范圍(C)、負離子m/z 500-1000范圍 (D)

本文相關內容由中國食品藥品檢定研究院的聶黎行研究員提供，詳細研究內容已正式發表于Frontiers in Pharmacology - Ethnopharmacology, 2021, https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685575。

文獻題目

《Microscopic Mass Spectrometry Imaging Reveals the Distributions of Phytochemicals in the Dried Root of Isatis indigotica》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Li-Xing Nie1,2, Jing Dong3, Lie-Yan Huang2, Xiu-Yu Qian2, Shuai Kang2,4*, Zhong Dai2 and Shuang-Cheng Ma1,2*

1 Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing, China

2 National Institutes for Food and Drug Control, National Medical Products Administration, Beijing, China

3 Shimadzu China Innovation Center, Beijing, China

4 College of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, China