黃皮不同部位中代謝物分子空間分布的質譜成像分析

黃皮（Cluasena lansium（Lour.）Skeels）屬于蕓香科(Rutaceae)黃皮屬(Clausena)中的一種特殊果樹，分布在中國南方地區。黃皮以其果實聞名于世，是非常受歡迎的熱帶保健水果，其根、莖、葉和種子也被廣泛應用于民間醫藥或中藥中。

以往對該植物的化學研究主要集中在尋找具有藥用價值的生物活性成分，到目前為止，已經分離和鑒定一系列天然產物，這些物質具有明顯的抗腫瘤、抗炎、抗氧化及降血糖等作用，主要包括咔唑類生物喊、香豆素類化合物、酰胺類生物堿、萜類和黃酮等。其中咔唑類生物堿和單萜基香豆素為其特征性成分。有關黃皮中活性成分的分離和測定方法已得到廣泛報道，然而，人們對黃皮特征代謝物在組織內的分布卻知之甚少。對黃皮果中的化學成分進行研究，探究其中具有藥用價值的生物活性成分空間分布信息，有助于理解植物代謝物合成的調控機制和功能基礎，對黃皮保健食品的開發具有重要意義。

質譜成像技術是近年來受到關注的一種新型的分子成像技術。基于高靈敏、高分辨、高通量特性的質譜結合先進的顯微成像技術，樣品制備過程不需要組織粉碎，無需標記即可實現多種物質在組織中的原位分布，為多種代謝物的研究提供了更多的信息維度。

本研究通過優化樣品前處理方法，采用基質輔助激光解吸/電離質譜成像技術(MALDI-MSI)對黃皮(Clausena lansium, Lour)的組織分布特征進行研究，為更好地開發、利用黃皮這一藥食兩用的水果資源提供理論基礎。本研究是首次利用質譜成像技術實現對黃皮小分子代謝物的系統研究（見圖1）。

圖1 利用質譜成像技術可視化黃皮不同組織中內源性分子分布

1. iMScope TRIO 成像質譜顯微鏡測試條件

將不同部位的組織塊包埋在2%羧甲基纖維素（CMC）中進行冷凍切片，切片厚度為 25μm，將所得組織切片放置在 ITO 導電載玻片上（100 Ω/m2，日本大阪松浪玻璃），將載玻片在真空干燥箱中干燥20分鐘。使用帶有0.22 mm噴嘴的噴槍（PS-270，GSI Creos，日本東京）和基質升華設備iMLayer（Shimadzu，Kyoto，日本）進行基質涂敷。在噴槍法中，使用1mL 40mg/mL DHB溶液（0.1%TFA，70%甲醇水配置）作為基質，噴槍與載玻片保持10cm的距離， 每噴霧10s后干燥5s，循環噴霧-干燥過程，直到將1 mL DHB溶液噴涂于切片并干燥*。對于升華法，使用iMLayer設備將基質升華于組織切片表面，厚度為0.7μm DHB。所有數據都是在裝有MALDI離子源的iMScope TRIO（Shimadzu，Kyoto，日本）上采集，質譜條件如下：正離子模式采集, 采集質量范圍 m/z 100-1000, 激光強度50。

2. 基于 iMScope TRIO 成像質譜顯微鏡的組織成像研究

采集黃皮植物不同部位作為研究樣品，分別對應果實、小莖、葉片。采用iMScope TRIO 成像質譜顯微鏡對三個不同部位的橫切面進行了生物堿、香豆素、糖及小分子酸等內源性分子的空間分布分析。

如圖2所示，3-甲基咔唑和Murrastinin在果實全果均有分布，尤其在果核含量特別豐富。在黃皮小莖中，這兩個物質主要存在于木質部和髓質部，表皮含量較低。此外，在葉片的上下表皮含量豐富。Murrayanine和heptaphylline這兩種咔唑堿僅分布于果肉組織中，莖中含有少量，果皮、果核和葉片中幾乎不存在。而Girinimbine只存在于黃皮果核外皮以及莖的外表皮。黃皮屬植物咔唑類化合物通過直接細胞毒性、誘導腫瘤細胞凋亡和/或免疫增強作用抑制腫瘤生長，他們的抗癌潛力引起了越來越多研究的興趣。通過定位該類物質的組織分布，可以有效提高活性成分的提取效率。

圖2  不同生物堿在黃皮果實、莖、葉片中空間分布的質譜成像圖

此外，如圖3所示，香豆素類化合物在黃皮中的分布是相似的，主要存在于果皮中。有報道稱，香豆素類化合物的抗氧化、抗癌及抗炎癥方面發揮重要作用。糖類廣泛存在于植物中，是植物快速儲能物質。

圖3  不同香豆素在黃皮果實、莖、葉片中的空間分布的質譜成像圖

如圖4所示，己糖（葡萄糖和果糖）主要分布在黃皮果實的果肉當中，蔗糖分布在果皮、果肉以及果肉中纖維上。水果中產生的蔗糖由蔗糖轉化酶水解成葡萄糖和果糖，黃皮切片中蔗糖的檢測強度約為己糖的4.7±1.4倍，說明黃皮中糖類主要以蔗糖的形式存在。據文獻報道，葡萄糖和果糖的甜度分別是蔗糖的0.75倍和1.7倍。因此，這很好地解釋為什么黃皮果品嘗比其他水果酸。

圖4  糖、有機酸及其他小分子在黃皮果實中空間分布的質譜成像圖

本研究結果有助于更好的了解黃皮內源性生物活性物質在不同組織部位的分布，為黃皮成分識別、質量評價、高值化利用等提供參考。

本文相關內容由廣東省農業科學院農業質量標準與監測技術研究所唐雪妹博士提供，詳細研究內容已正式發表于Phytochemistry, 2021, 192:112930.

文獻題目

《Visualizing the spatial distribution of metabolites in Clausena lansium (Lour.) skeels using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Xuemei Tang ^a,b, Meiyan Zhao ^a, Zhiting Chen ^a, Jianxiang Huang ^a,b, Yan Chen a,

Fuhua Wang ^a,b, Kai Wan ^a,b,*  

a Institute of Quality Standard and Monitoring Technology for Agro-products of Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, 510640, China

b Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-product Safety and Quality (Guangzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, China

* Corresponding author. Institute of Quality Standard and Monitoring Technology for Agro-products of Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, 510640, China.

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