內皮細胞培養基的背景與應用！

一、背景

內皮細胞培養基是專門為正常人類微血管內皮細胞體外培養設計的其生長的*培養基。是經滅菌的液體培養基，包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和低濃度胎牛血清(5%)。該培養基緩沖體系為重碳酸鹽，在含5%CO2的細胞培養箱中平衡后pH值為7.4。該培養基的配方能夠選擇性的促進正常人類微血管內皮細胞體外培養中的增殖和生長，并為其達到營養平衡狀態。

內皮細胞是一薄層的上皮細胞，由一層扁平細胞所組成，呈多邊形，細胞的邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合。內皮細胞也稱血管內皮細胞，通常指襯于心、血管和淋巴管內表面的單層扁平上皮，它形成血管的內壁。它們具有吞噬異物、細菌、壞死和衰老的組織，還參與機體免疫活動功能。

血管內皮細胞（EC）位于血漿與血管組織之間，它不僅能完成血漿和組織液的代謝交換，并且能合成和分泌多種生物活性物質，以保證血管正常的收縮和舒張，起到維持血管張力，調節血壓以及凝血與抗凝平衡等特殊功能，進而保持血液的正常流動和血管的長期通暢。抗凝血材料表面內皮細胞化，可以減少血栓的形成和血小板激活。

完整內皮細胞化是抗凝血，表面血管內皮組織是天然的抗凝血組織。內皮細胞膜上有天然的抗凝血成分，比如肝素，前列腺素（PGI），一氧化氮等，內皮細胞能夠合成和分泌多種內皮衍生舒張因子。

二、應用

用于角膜內皮細胞體外培養模型的建立：

通過對四個部分結果的綜合分析得出角膜內皮細胞的體外培養模型。

1、剝離帶后彈力層的兔角膜內皮片，用雙酶消化法（胰蛋白酶和膠原酶）及組織片法對角膜內皮細胞進行分離培養，倒置顯微鏡下觀察角膜內皮細胞生長情況，經觀察分析得出的細胞數量多、污染少的較好分離方法，為后續階段采用。

2、選取F99培養基、DMEM/F12培養基、KSFM培養基三種培養基分別對兔角膜內皮細胞進行原代及傳代培養，倒置顯微鏡下觀察角膜內皮細胞生長情況。經分析討論得出細胞增殖快、細胞形態好的培養基，后續階段沿用。

3、采用消化法、與3T3細胞共培養法、細胞克隆培養法對兔角膜內皮細胞進行培養，倒置顯微鏡下觀察角膜內皮細胞生長情況，得出細胞傳代快、傳代較久的培養方法。

4、對人、豬、小鼠、兔角膜內皮細胞進行體外培養，并進行細胞形態學觀察及免疫熒光鑒定，選出細胞形態維持好、傳代時間長的一種角膜內皮細胞。

三、結果

1、經雙酶消化法培養20天后，兔角膜內皮細胞呈多邊形或多角星形，細胞形成單層，未見長梭形的兔角膜基質細胞。組織片法培養2周后可見及部分呈長梭型放射狀生長的兔角膜基質細胞生長其中。

2、F99培養基中培養的原代兔角膜內皮細胞在第25天融合成單層，細胞呈多角形、細胞數量多，在三種培養基中細胞形態最規則，細胞數目最多，融合時間。第2次傳代的第4天，F99培養基培養的兔角膜內皮細胞數最多，且形態規則。

3、消化法中經消化后細胞貼附快，細胞形態好，消化傳代后，細胞培養4-5天即形成新的單層細胞，在傳至第10代后仍維持較好的生長態勢。而兔角膜內皮細胞與3T3細胞共培養后，第5天可見明顯的兔角膜內皮細胞團，細胞呈密集的“鵝卵石”樣形態。培養至第14天細胞團內細胞數明顯減少，剩余的細胞呈細胞核體積增大、顏色加深的衰老跡象。克隆培養法中角膜內皮細胞在培養7天后形成克隆球，擴大培養2代后細胞體積變大，增殖緩慢。

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