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高速3D激光共聚焦顯微鏡是一種高速共聚焦激光掃描顯微鏡，可用于精確可靠的三維（3D）測量。實時共聚焦顯微鏡圖像可以通過快速光學掃描模塊和信號處理算法實現。這是一種很有前景的解決方案，可用于測量和檢查半導體晶圓、FPD產品、MEMS器件、玻璃基板和材料表面等微3D結構，并通過快速光學掃描模塊和信號處理算法實現實時共聚焦微圖像。
高速3D激光共聚焦顯微鏡用點光源照射試樣，在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑。光斑照射后發出的熒光被物鏡收集，沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡。光譜儀將熒光直接發送到檢測器。光源和探測器前面有一個針孔，分別稱為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同，約100-200納米；與焦平面上的光斑相比，兩者是共軛的，即光斑可以通過一系列透鏡同時聚焦在照明針孔和檢測針孔上。這樣，來自焦平面的光可以會聚在檢測孔范圍內，而來自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外而無法成像。激光逐點掃描樣本，檢測到針孔后的光電倍增管也逐點獲得相應光點的共焦圖像，將其轉化為數字信號傳輸至計算機。最后，整個焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上。
每個焦平面圖像實際上是樣品的光學橫截面，這種光學截面總是具有一定的厚度，也稱為光學片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，且非焦平面光被針孔過濾，因此共焦系統的景深近似為零。沿z軸掃描可實現光學斷層掃描，并在待觀察樣品的焦斑處形成二維光學切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與z軸（光軸）掃描相結合，將連續層次的二維圖像進行累加，經專用計算機軟件處理，即可得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點上，使得聚焦平面外激發的熒光無法進入檢測針孔。
高速3D激光共聚焦顯微鏡工作原理的簡單表述就是以激光為光源，在傳統熒光顯微鏡成像的基礎上增加激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，進行數字圖像采集和處理，系統通過計算機控制。
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