1、介紹

       蛋白質化學家一直希望在中紅外區（mid-IR）跟蹤蛋白質的折疊動力學，以便更好地了解蛋白質的折疊過程，并獲得折疊過程中二級結構變化的信息。傳統上，動力學停流裝置是耦合到傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀。盡管FT-IR技術的進步和步進掃描采集的使用，這種快速動力學裝置的主要限制通常是FT-IR光譜儀的時間分辨率。最快的采集速度通常在30-50 ms范圍內（甚至更長），因此它與Bio-Logic SFM的幾毫秒死時間（使用FTIR池）不匹配。實際上，這些光譜儀是為穩態研究應用而設計的，干涉儀的使用限制了數據采集的速度。因此，用這種技術不可能觀察到短于100-200ms的快速動力學過程。

       一些自制的紅外探測系統已在實驗室中開發1，以達到這種采集速度并獲得毫秒分辨率，但到目前為止，還沒有一個商業化。

圖1 SFM-4000與IRis-F1（IRsweep）連接。

性能參數：

·5ms死時間

·75-100 μl每次注射樣品體積

·臍帶容積200μl

·單、雙、三混

· 100 μm至500μm光程

·紅外光譜4μs采集時間

·0.3cm-1分辨率下1000光譜/秒連續反應監測

·10-3 AU單次注射的噪聲水平

       另一個限制是分光計的信噪比，因為它與采集速度直接相關。具有更快采集速度的商用FT-IR光譜儀通常需要對多次停流曲線進行平均，以提高信噪比，這在紅外區域內需要處理珍貴或濃縮樣品時會出現問題。

       為了克服傅立葉變換紅外光譜儀的采集速度和靈敏度問題，IRsweep2公司研制了一種基于雙梳光譜的新型紅外光譜儀。IRsweep公司的IRis-F1光譜儀是一種雙梳光譜儀，專為快速動力學測量而設計。本應用說明的目的是說明如何將Bio-Logic SFM與IRsweep IRis-F1連接起來，以毫秒時間標度跟蹤反應，并觀察之前沒有見過的中紅外反應現象。

2、什么是雙梳光譜？

       雙梳狀光譜儀的原理與傳統的傅里葉變換或色散光譜儀*不同。兩個緊密匹配的激光源發射的寬帶紅外光束（頻率梳）通過樣品后疊加在單個探測器元件上。檢測到的光的波長是根據在探測器上觀察到的射頻信號的頻率來解析的。由于不需要運動部件，一次實驗只需4微秒就能記錄到完整的紅外光譜。因此，如本應用說明所示，通過停流技術研究的毫秒反應動力學可以很容易地遵循在*信噪比下的紅外光譜特征。基于高功率激光源，雙梳光譜儀還具有高亮度，允許在強吸收溶劑中進行高光譜和時間分辨率的測量。

3、實驗裝置

       本應用筆記中使用了SFM-4000和IRis-F1光譜儀（見圖1）。SFM-4000有3個混合器和4個注射器，由獨立的步進電機驅動，使用戶可以*控制體積、注射速度和混合比。SFM的FTIR附件與Iris-F1樣品室*兼容。

       流通池使用CaF2窗口，用戶可以通過改變窗戶之間的間隔物在100μm至500μm自由改變光程。在本應用筆記中，安裝的是100μm光程，對應是15μl的死體積（從最后一個混合器到流通池中心）。因此，使用3ml/s的流速，對應的死時間為5ms。最后一個混合器直接集成到FT-IR附件中，以最小化死體積。

       SFM-4000主體通過臍帶連接器連接到FT-IR流動池，臍帶將來自混合器2出口和注射器4的溶液輸送到最后一個混合器，進入最終混合階段。通過硬截止閥與停止電機的同步來確保液流的瞬時停止。停止流量推送和IRis-F1之間的同步是使用5V TTL觸發器實現的。

4、β-乳球蛋白結構改變

       β-乳球蛋白的二級結構在用三氟乙醇作為變性劑中從β-折疊到α-螺旋的快速轉變由Gerwert等人描述4。這種快速反應用于演示SFM-4000和IRis-F1耦合的性能。

       二級結構的轉變是通過1:1的比例混合濃度25mg/ml的在10%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中的β- 乳球蛋白，與60%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中（見圖2），導致三氟乙醇的濃度變化從10%V到35%V。

圖2用于β- 乳球蛋白反應的混合序列

       用氘化水和鹽酸來避免H2O在1650cm-1處的強背景吸收。實驗采用每種溶液100μl和3 ml/s的總速度注入，導致5 ms的死時間。

       以每次4μs連續采集130毫秒得到光譜。對應于反應初始狀態的預觸發光譜被用作吸收光譜的背景。在后處理中，光譜在1ms內進行共平均，光譜以3cm-1進行平均。

圖3 反應10ms獲得的紅外光譜。可見的連續偏移。

       圖3顯示了10 ms測量的紅外光譜的演變，1635 cm-1和1660 cm-1處的譜帶證實了快速中間體的存在，如Gerwert等人所觀察到的。

圖4 β-乳球蛋白結構改變：DA時間痕跡， 4次停流注射的平均

       圖4顯示了通過減去1623 cm-1處的吸光度校正基線漂移后4次停流實驗的平均值。反應在約100ms內完成，但在10ms以下的早期可以獲得非常明確的信號。

5、結論

       使用標準FT-IR和臍帶連接器附件，Bio-Logic SFM可以很容易地耦合到Iris-F1雙梳光譜儀。使得小于10ms的生化反應動力學可以在中紅外區進行研究，而傳統的紅外光譜實驗是受限的。

       利用IRis-F1，在10-3 AU（吸光度單位）下以1ms的時間分辨率獲得單次停流注射的吸光度譜。共同平均多次注射或降低時間分辨率，靈敏度可以進一步提高。

       所述實驗僅使用的SFM-4000兩個注射器，但如果用戶希望編程自動濃度研究或雙重混合實驗，則可以使用額外的兩個注射器，在這種情況下，使用一條臍帶線作為延遲線來老化第一次混合。SFM-2000和SFM-3000也可以與IRis-F1光譜儀耦合。

參考文獻：

1) J. Tang, F. Gai, A Millisecond Infrared Stopped-Flow Apparatus. Applied Spectroscopy. 

2) A. Hugi, G. Villares, S. Blaser, H.C. Liu, J. Faist, Mid-infrared frequency comb based on a quantum cascade laser. Nature 

3)  Kauffmann, E., Gerwert, K. et al.