基因工程細胞的同質性對于很多應用都是必要條件，例如細胞株開發、基因治療、組織工程以及細胞治療與再生醫學。CRISPR/Cas9基因編輯存在脫靶等情況，無法直接得到均質的細胞，因此需要開展單細胞克隆，之后才能用于臨床。

CloneSelect單細胞分離系統（CloneSelect Single Cell Printer）采用類似噴墨打印的技術，柔和地產生包裹細胞的液滴無接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時，該系統借助智能圖像分析，確認細胞數目，分析細胞的形態（大小和圓度）及熒光強度，聯動的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個細胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細胞液滴則分配至微孔板，從而實現對單個細胞的分選和接種。單細胞分離系統是一種可比移液器操作的柔和的單細胞分離技術，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會降低敏感細胞和部分受損細胞（如電轉后的細胞）的成克隆率，因此單細胞分離系統更適用于基因工程細胞的克隆，維持細胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據。

圖1：CloneSelect f.sight單細胞分離系統

近發表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對間充質干細胞（MSC）開展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個實驗流程起始于轉染，接著用CloneSelect f.sight單細胞分離系統開展單細胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質水平開展分析，后開展細胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質干細胞的單細胞克隆及分析流程。（圖片來源：文獻1）。

 

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質粒中加入了GFP基因，轉染間充質干細胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統分選出轉染成功的單細胞。系統可設定細胞直徑、圓度和熒光強度等指標，分選出單個活細胞并接種至微孔板。圖3為系統分選基因編輯的間充質干細胞的5張連續的圖像。通過瀏覽單細胞分離過程中記錄的5張連續的圖像，作者統計單細胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細胞孔，或空孔或無法確認（圖4）。這一結果表明f.sight單細胞分離系統可以準確地識別細胞并成功將其接種至微孔內。

圖3：CloneSelect f.sight系統分選間充質干細胞時采集的5張連續圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來源：文獻1）。

 

除了帶GFP的基因敲除質粒外，作者還將pmaxGFP質粒轉染至間充質干細胞作為對照用于評估單細胞分離效率和克隆率。此外，作者轉染了多個不同的基因敲除質粒。雖然不同的質粒因為大小不同而呈現各異的轉染效率，但是成克隆率都達到了30%。此外，作者還發現轉染質粒的間充質干細胞（31.3±8%）和未轉染的間充質干細胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細胞分選過程柔和，因此產生的系統偏差較小（圖4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細胞分離系統的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來源：文獻1）。

 

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質水平對基因編輯后的間充質單細胞開展分析。后作者選出一株雙等位基因敲除的間充質干細胞（g23d）檢測其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對照開展平行實驗。細胞轉移到成骨分化培養基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細胞失去細長的成纖維細胞樣形態，開始呈現出成骨細胞樣的形態，然后在第21天開始出現鈣沉積，發展過程與親本的MSC對照類似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒有因為基因編輯和篩選過程而受到影響。

 

圖5：RANKL基因敲除的間充質干細胞（g23d）和親本間充質干細胞的培養和成骨分化。（圖片來源：文獻1）。

 

在這個研究中，作者搭建了一整套實驗流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質各個水平的分析和細胞功能測試。實驗流程中采用CloneSelect f.sight單細胞分離系統成功高效地分選出基因編輯后帶GFP的間充質干細胞。單細胞接種效率高達93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達31.3% (±8%)。相比傳統的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細胞分離系統具有高效率，高活率，操作簡單，單克隆性證據充分等優勢，是基因工程細胞克隆的理想工具。