1 原理及用途

    本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產組織、畜禽組織、肝臟、蛋類、蜂蜜、牛奶及飼料等樣品中的氯霉素藥物（Chloramphenicol，Cap），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的氯霉素藥物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗氯霉素藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含氯霉素藥物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中氯霉素藥物的殘留量。、

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb

2.2 反應模式：25℃，30min～30min～15min。

2.3 樣本檢測下限：

蛋類、牛奶（方法一）……………………0.1ppb

尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉………0.05ppb

組織、肝臟、蜂蜜、牛奶（方法二）……0.025ppb

2.4 交叉反應率：

氯霉素 ………………………………………100%

甲砜霉素……………………………………＜0.1%

氟甲砜霉素…………………………………＜0.1%

2.5 樣本回收率：

組織、肝臟…………………………………85%±20%

蜂蜜、腸衣…………………………………85%±25%

牛奶、飼料…………………………………75%±25%

尿液、血清…………………………………70%±20%

3 試劑盒組成

酶標板………………………………………96孔

標準品（綠蓋）：各1ml

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

高標準品（紅蓋）：100ppb…………………1ml

酶標記物(紅蓋)………………………………11ml

抗體工作液(藍蓋)……………………………5.5ml

底物液A(白蓋)………………………………6ml

底物液B(黑蓋)………………………………6ml

終止液(黃蓋)…………………………………6ml

20X濃縮洗滌液(白蓋)……………………40 ml

2X復溶液(黃蓋)………………………………50 ml

說明書 …………………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、醋酸鈉、醋酸

、亞硝基鐵（K2Fe(CN)5(NO)?2H2O）、葡萄糖苷酸酶、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

    實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵溶液（牛奶、奶粉樣本）

11.9g亞硝基鐵加去離子水至100ml溶解。

配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）

    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。

配液3：0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液（尿液樣本）

    2.4g醋酸鈉加去離子水500ml溶解，加1.2ml醋酸混勻。

配液4：乙腈-水溶液

    V乙腈:V水=84:16

配液5：樣本復溶液

    2×復溶液在使用前按1:1用去離子水稀釋，用于樣本提取后的復溶。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織、肝臟樣本處理方法

1）稱取均質后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，先加入3ml去離子水振蕩混勻，再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體4ml在50-60℃下氮氣吹干；

3）加入用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入1ml樣本復溶液混合30秒，室溫4000轉/分離心5分鐘；

4）去除上層有機相相，取下層水相50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：0.5倍

5.3.2 血清、血漿樣本處理方法

1）取1ml血清或血漿至離心管中，加入2ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，室溫4000轉/分離心5分鐘，或靜置使水相與有機相分離；

2）取全部上層液體在50-60℃下氮氣吹干；

3）用1ml樣本復溶液溶解干燥的殘渣，混合30秒，室溫4000轉/分離心5分鐘；

4）去除上層有機相相，取下層水相50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：1倍

5.3.3 尿液樣本處理方法

1）取2ml尿液至離心管中，加入0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液0.5ml混合，加40ul葡萄糖苷酸酶，混勻，37℃水解2小時以上（或過夜）；

2）將上述溶液恢復至室溫后加入8ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘，取4ml上層液體在50-60℃下氮氣吹干；

3）用1ml樣本復溶液溶解干燥的殘渣，混合30秒；

4）取50μl進行分析。 

    樣本稀釋倍數：1倍

5.3.4 蜂蜜樣本處理方法

1）取2±0.05g蜂蜜于離心管中，用4ml去離子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干；

3）用0.5ml樣本復溶液溶解干燥的殘渣，混合30秒；

4）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：0.5倍

（檢測下限0.025ppb，定量下限0.1ppb，因某些樣本有干擾建議以0.1ppb作為陽性判定值）

5.3.5 腸衣樣本處理方法

1）腸衣經清洗后均質，稱取均質后的樣本1±0.05g于50ml離心管中，加入10ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體5ml在50-60℃下氮氣吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入0.5ml樣本復溶液溶振蕩混合30秒，室溫4000轉/分離心5分鐘；

4）去除上層有機相相，取下層水相50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：1倍

5.3.6 牛奶樣本處理方法一

1）將牛奶樣本15℃4000轉/分離心10分鐘，去除上層脂肪，取5ml去脂肪奶樣于50ml離心管中，加150ul 亞硝基鐵溶液（配液1）振蕩混合30秒，加150ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體加等量樣本復溶液溶振蕩混合30秒，

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：2倍（檢測下限0.1ppb，定量下限0.15ppb）

5.3.7 牛奶樣本處理方法二

1）將牛奶樣本15℃4000轉/分離心10分鐘，去除上層脂肪，取5ml去脂肪奶樣于50ml離心管中，加250ul 亞硝基鐵溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體2.2ml（相當于2ml鮮奶）于另一離心管中，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

3）取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干；

4）用0.5ml樣本復溶液溶溶解干燥的殘渣，混合30秒；

5）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：0.5倍（檢測下限0.025ppb，定量下限0.05ppb，因某些樣本有干擾建議以0.15ppb作為陽性判定值）

5.3.8 奶粉樣本處理方法

1）取2±0.05g奶粉于50ml離心管中，用10ml去離子水溶解，加入1ml 亞硝基鐵溶液（配液1）和1ml 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合，15℃4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體3.6ml（相當于0.6g奶粉）于另一離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

3）取上層液體4ml在50-60℃下氮氣吹干；

4）用0.4ml樣本復溶液溶溶解干燥的殘渣，混合30秒；

5）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：1倍（檢測下限0.05ppb，定量下限0.15ppb，因某些樣本有干擾建議以0.15ppb作為陽性判定值）

 5.3.9 蛋類樣本處理方法

1）取3±0.05g均質的蛋類樣本于50ml離心管中，加9ml乙腈-水溶液振蕩混合2分鐘，15℃4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體3ml于另一離心管中，加入3ml去離子水，再加4.5ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，5℃4000轉/分離心10分鐘；

3）取全部上層液體在50-60℃下氮氣吹干；

4）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入2ml樣本復溶液溶振蕩混合30秒，室溫4000轉/分離心5分鐘；

4）去除上層有機相相，取下層水相50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：2倍（檢測下限0.1ppb，定量下限0.3ppb）

5.3.10 飼料樣本處理方法

1）取2±0.05g均質的飼料于50ml離心管中，用2ml去離子水溶解，再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，15℃4000轉/分離心10分鐘；

2）取上層液體3ml載50-60℃下氮氣吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入1ml樣本復溶液溶振蕩混合30秒，室溫4000轉/分離心5分鐘；

4）去除上層有機相相，取下層水相50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：1倍

6 酶聯免疫實驗步驟

將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需：

將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干。

6.4 加酶反應：加酶標記物100µl/孔，25℃避光反應30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個標準（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A：標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0：0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準品百分吸光率為縱坐標，對應的標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準品的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（咨詢索?。?/p>

8 注意事項

8.1 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低。不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液具有腐蝕性，如不慎接觸皮膚或衣物請立即用大量自來水沖洗。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒

——尋夢環游記

如果說世上除了死亡，還有什么會把人分隔在兩個世界，我想答案應該是阿爾茲海默?。ˋD）。這個疾病大家一定不會覺得陌生，在許多影視劇、公益廣告和小說作品里都有它的身影，比如都挺好里的蘇大強，綜藝節目《忘不了餐廳》，電影《依然愛麗絲》……在我們為難能可貴的親情感動之余，對阿爾茲海默病的了解也加深了。

即便如此，不了解甚至歧視這種病的大有人在。為了提高人們對AD的認識，阿爾茨海默病協會（ADI）以每年的9月作為世界阿爾茨海默病月，并將每年的9月21日定為世界阿爾茨海默病日。今年活動月的主題為“Let’s talk about dementia”。號召全社會能夠從內心去改變，積極地關注患病的人而不是病，給患者及家庭以尊重、以力量，使他們面對困境不再回避，面對疾病更加從容。

阿爾茲海默病概述

AD是一種進行性和不可逆的神經退行性疾病，大概占所有癡呆病例的60％~80％。記憶力減退是AD見的癥狀。一開始，遺忘可能是微妙的，但隨著時間的推移，記憶的喪失會惡化，直到它干擾日常生活。即使在熟悉的環境中，患有AD的人也可能迷路或迷茫。受影響的人越來越需要穿衣，吃飯和個人護理方面的幫助。

隨著疾病的進展，一些患有阿爾茨海默病的人會經歷個性和行為的改變，并且難以以適合社交生活。其他常見癥狀包括躁動、煩躁不安和語言能力喪失等。隨著老齡化進程的加快，罹患阿爾茨海默癥的人數也在逐年增長。據統計，2018年有5000萬左右的人患有AD， 預測到2050年患病總人數將超過1.3億人。由于受影響的人數以及疾病的緩慢和可怕的過程，AD造成了很高的經濟和社會負擔。預計到2030年，經濟負擔將增加到2萬億美元。遺憾的是，目前還沒有治療AD的有效方法。

阿爾茨海默病的發病機制

AD的病因尚未明確，科學家們提出了很多假說，目前*的病因是腦內的老年斑和神經原纖維纏結的積聚，老年斑由β-淀粉樣蛋白（Aβ）構成，神經原纖維纏結，則由tau蛋白異常磷酸化導致。

圖1. 根據淀粉樣蛋白假說，在AD出現臨床癥狀前數十年，病理變化已經悄然發生

通常，兩種蛋白質聚集體的形成始于海馬體并影響與基底前腦、丘腦和下丘腦相互作用的細胞，這是形成記憶所必需的結構。隨著蛋白質的擴散，神經元會死亡，腦組織的總體積也會減少。已經證明，與健康成人對比，由于腦組織大小減少，可以根據腦部掃描識別患有輕度認知障礙或晚期AD的患者。

圖2. 健康成人與AD患者腦組織對比及AD典型的病理變化

并不是所有人都支持由此衍生的兩大假說，關于AD的發病機制，研究人員還提出了別的假說。比如：炎癥被認為是一個重要原因。在阿爾茨海默病的后期階段，大腦的免疫細胞（稱為小膠質細胞）進入超速狀態，殺死神經元。一些研究人員認為這是導致癡呆大多數癥狀的原因，這意味著炎癥可能是一個有價值的方向；一些研究人員認為，某些感染可引起阿爾茨海默病，這表明抗菌藥物或抗病物可能具有治療價值。Ruth Itzhaki于1997年發表的一項研究表明，HSV感染和APOEε4基因變異的組合賦予了AD很大的發病風險。2016年，Itzhaki和幾位同事在“阿爾茨海默病雜志”上發表了一篇社論，聲稱微生物在阿爾茨海默病中的作用被忽視，需要進行更多的研究，包括抗菌藥物的試驗。此外，很多研究者也將目光投向基因檢測，例如，有研究將上萬個AD患者的DNA信息與其他沒有患病的老年人進行比較，從而篩選出可能與AD發病相關的基因；一些研究通過外顯子測序發現一些與AD相關的突變位點，然后通過基因敲除、點突變或基因敲除動物模型進一步驗證這些新基因或新突變是否是會導致AD發病。

阿爾茲海默癥的治療和藥物研發

他克林是一種獲FDA批準用于治療AD相關記憶喪失和認知障礙的藥物。從那時起，市場上又引入了四種藥物，目前用于治療AD的認知問題。其中三種藥物是乙酰膽堿酯酶抑制劑 ，它們是卡巴拉汀，加蘭他敏和多奈哌齊。另一種藥物美金剛 ， 是一種NMDA受體激動劑。這些藥物通過保持思維，記憶或說話技巧，幫助個人開展日?；顒印Ｋ麄冞€可以幫助解決與AD相關的一些行為和個性變化。 但是，它們都不能逆轉、停止甚至減緩病情的發展。

隨著研究人員對AD的了解越來越多，人們越來越意識到有效治療需要針對多種因素，包括遺傳、免疫系統和生活方式，早期干預可能是成功治療的關鍵。

阿爾茲海默癥的危險因素

基因：大約1％的AD病例是由基因APP，PSEN1或PSEN2的突變引起的，這些突變影響β-淀粉樣蛋白的加工。 APOE和TREM2中的某些突變可以增加發生散發性阿爾茲海默癥的風險。

性別：女性阿爾茨海默病的總發病率是男性的兩倍。這種差異不能用女性有著更長的預期壽命來解釋，但荷爾蒙和生活方式可能起到一定的作用。

生活方式：這些包括糖尿病、肥胖、抑郁、吸煙和教育程度低。

阿爾茨海默癥體內研究的動物模型

1995年，誕生了 一個具有AD樣神經病變的轉基因小鼠—PDAPP小鼠，在大腦中表達高水平的人突變APP，并且能發展出AD包括斑塊和認知缺陷的許多標志。從那時起，許多嚙齒動物模型已被開發用于研究AD。

表達人類APP突變體(K670N/M671L、V717I、V717F和D23N系)， PSEN1(PS1系)和PSEN2(PS2系)突變體的小鼠均表現出漸進的、早發型的癡呆癥狀，但都缺乏神經元纖維纏結的形成。目前，已有成熟的雙轉基因APP/PS小鼠和三轉基因3×Tg小鼠系(包含人類APP、PS1突變和Tau突變)模型用于AD研究。5×FAD小鼠系是結合三個人類APP突變體和兩個PS1突變建立起來的，該小鼠模型更早地出現淀粉樣病變、認知障礙及神經元損失。這些多轉基因小鼠較單轉基因小鼠的病理表現與阿爾茲海默癥更相似，具有更高的應用前景。不過這些模型難以評估一些新發現的基因突變是否對AD的發生發展有影響。

雖然目前研究AD的動物模型有其局限性，但它們各有特點，對于推進AD的治療和研究至關重要。由于不同的模型可能會得到不同的結果，許多研究人員在他們的研究中使用多種AD模型或者將基因編輯鼠和其它方法結合產生復合模型來更好地研究AD。

幾十年來，β-淀粉樣蛋白（Aβ）一直主導著AD的研究—這也許是以犧牲其他有價值的想法為代價。隨著近年來以淀粉樣蛋白假說為基礎的多種藥物在臨床試驗中不斷“戰敗沙場”，一些研究人員認為現在是探索替代途徑的時候了。阿爾茲海默癥的研究，任重而道遠，希望科學家們和藥企早日攻破難關，為患者及親屬帶來希望的曙光。

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