毒性蛋白質病(Proteinopathy)通常由細胞內或細胞外沉積大量折疊變異的蛋白質(Misfolded protein)所致。在蛋白合成和成熟過程中的任何一個環節出現問題，如蛋白突變、折疊以及翻譯后修飾出現異常都有可能會導致蛋白質病的發生。雖然蛋白質病這個術語對很多人來說還比較陌生，但現已證明其和多種嚴重的神經性疾病，如阿爾茲海默癥、帕金森病和肌萎縮性側索硬化癥(ALS)的發生密切相關。靶向蛋白質病的研究也為屢屢受挫的神經退行性疾病治療提供了新的曙光^[1,2]。

高內涵整體解決方案的優異體現

在七月的Cell主刊中，研究將目光轉至由MUC1基因移碼突變導致的腎病(MUC1 kidney disease ,MKD)^[3]。與神經性退行性疾病類似，MKD目前尚無有效治療手段。結合細胞系、小鼠模型、病人組織和日益火熱的類器官來源樣本，研究證實MUC1突變蛋白(MUC1-fs)會大量聚集在細胞內，并終激活未折疊蛋白應答(Unfolded protein response UPR)，誘發細胞損傷和毒性。因此，MKD也屬于蛋白質病的一種。針對該發病機制，研究實施基于高內涵平臺的高通量篩選，并成功獲得能特異清除突變MUC1蛋白的小分子藥物BRD4780。該研究不僅深入我們對蛋白轉運異常發生機制的了解，也為多種毒性蛋白質病提供了新的治療策略和切入點。在七月的研究熱點版塊中，Nature Review Drug Discovery專門針對發現進行了解析^[4]。

該研究也體現了珀金埃爾默高內涵整體解決方案的應用。成像平臺Opera Phenix配合CellCarrier Ultra系列微孔板主導高內涵篩選的同時，并通過水鏡優勢參與了基于上述四種樣本的所有熒光拍攝和動態追蹤分析細胞凋亡進程。針對類器官樣本的拍攝，PreciScan功能被用于提速拍攝進程和排除不需要的圖像采集和分析。所有的熒光分析由Harmony軟件完成，尤其是‘spot’分析功能的應用。

a疾病解析

通過MKD病人和體外模型等樣本，研究使用抗體染色方式分析野生型MUC1和對應突變產物的組織和細胞分布。在不同來源的樣本中，值得一提的是基于病人誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells , iPS cells)建立的類器官(Organoid)樣本。基于干細胞技術的類器官模型建立和分析也是近年來高內涵的優勢應用方向之一^[5]。與病人的切片結果一致，野生型MUC1主要分布在類器官的頂膜部位，而突變蛋白則分布在細胞內。進一步研究證明聚集在細胞內的突變MUC1會誘發細胞應激，活化ATF6-UPR通路并終導致細胞損傷，表明MKD是蛋白質病。

基于MKD病人的腎類器官模型染色，圖片由Opera Phenix拍攝。

紅色指示野生型MUC1蛋白；綠色指示突變體MUC1蛋白；藍色為E-cadherin；黃色為Na/K ATPase標記基底外側膜。

b高內涵篩選

為了發現能有效清除突變蛋白的藥物，研究針對病人樣本建立永生化細胞系，并利用Opera Phenix開展大規模、多指標高內涵篩選。在初篩中，研究關注能清除突變蛋白并無顯著細胞毒性的藥物，并在此基礎上細化篩選藥物濃度開展二輪篩選。通過兩輪篩選后，研究通過特異性、mRNA水平調控和是否能抑制ER應激藥物thapsigargin的細胞毒性三個指標來進一步分析候選藥物。

高內涵篩選流程圖

終，從3713種化合物中，研究成功發現BRD4780滿足上述的指標，能有效特異清除突變蛋白的同時不影響MUC1轉錄水平，并能保護病人模型細胞系不受thapsigargin的應激壓力。進一步的實驗證明BRD4780能工作于類器官模型和小鼠模型，是非常有潛力的MKD治療藥物。

左圖：基于細胞系的染色結果，黃色指示野生型MUC1蛋白；綠色指示突變體MUC1蛋白；灰色指示細胞核。

右圖：對應的統計分析和細胞數變化分析。

c機制研究

為了解析MUC1突變體亞細胞聚集原理和BRD4780工作機制，研究利用成像技術進行大量共定位研究，并發現病人來源細胞系中MUC1突變體滯留在內質網和高爾基體之間的早期分泌通路中，并與運貨受體TMED9有顯著的共定位趨勢，且這個現象能進一步在多種模型和病人組織中重現。通過動態成像追蹤，研究證明BRD4780能將滯留的突變蛋白從早期分泌途徑中釋放出來，并促進其進入溶酶體降解途徑。

基于細胞系的亞細胞共定位研究，分析基于Harmony軟件的‘spot’ 分析功能。

基于細胞系、小鼠模型、病人組織和類器官來源樣本的熒光染色分析，紅色指示TMED9；綠色指示突變體MUC1蛋白；灰色指示細胞核。

* 熒光圖片均由Opera phenix 拍攝。

非常有意思的是，在病人樣本中研究同時也發現TMED9蛋白水平的上升，而BRD4780處理同樣能降低TMED9蛋白水平。此外，通過CRISPR技術敲除TMED9能表型模擬BRD4780的處理效果，清除突變蛋白。因此，TMED9參與了MUC1突變體在早期分泌途徑的滯留和積累，并可能是BRD4780的直接作用靶點。針對此，研究采取細胞熱移位測定法(Cellular thermal shift assay，CETSA)證實細胞內BRD4708和TMED9存在直接相互作用。憑借其能在生理條件下進行細胞水平分析的優勢，CETSA成為了內源蛋白-藥物相互作用分析技術的生力軍，是表性篩選下游藥物解析的利器。

基于CETSA方法在細胞水平確認BRD4708能直接結合TMED9

綜合上述的發現，研究向我們闡釋了MKD的發病以及BRD4780的作用機制。通過直接結合TMED9，BRD4780將突變的MUC1蛋白從內質網和高爾基體之間的早期分泌通路中釋放出來，加速溶酶體對其的清除。令人興奮的是，在具有很好的藥理性質的同時，BRD4780不僅能作用于MKD，還能作用于其他多種膜相關蛋白導致的毒性蛋白質病，如UMOD突變相關的慢性腎病和色素性視網膜炎等，是非常有潛力的候選藥物。

MKD的發病機制和BRD4780的作用機制圖

同時，該研究也是高內涵兩大應用領域的精華案例。首先是亞細胞水平成像應用，研究中涉及到的大量定位、共定位研究和動態追蹤蛋白轉運過程都是高內涵的優勢應用場景。其次，更為關鍵的是，該研究也是成像篩選主導的藥物發現案例。從疾病模型表型的建立到靶向逆轉疾病相關表型的篩選，和后下游的藥物機制研究，都離不開珀金埃爾默高內涵解決方案。高內涵解決方案，伴隨著機器學習的逐漸成熟，將成為創新藥物研發行業的新鮮血液^[6]。

參考文獻

1. Ganguly G, et al.Proteinopathy, oxidative stress and mitochondrial dysfunction: cross talk in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Drug Des Devel Ther. 2017 Mar 16;11:797-810.

2. Scotter EL, et al.TDP-43 Proteinopathy and ALS: Insights into Disease Mechanisms and Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 2015 Apr;12(2):352-63. doi: 10.1007/s13311-015-0338-x.

3. Dvela-Levitt M, et al.Small Molecule Targets TMED9 and Promotes Lysosomal Degradation to Reverse Proteinopathy. Cell. 2019 Jul 25;178(3):521-535.e23.

4. A novel approach to reverse proteinopathies https://www.nature.com/articles/d41573-019-00133-5

5. Czerniecki SM, et al.High-Throughput ScreeningEnhancesKidneyOrganoid Differentiation from HumanPluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping. Cell Stem Cell. 2018 Jun 1;22(6):929-940.e4.

6. Machine learning brings cell imaging promises into focus https://www.nature.com/articles/d41573-019-00144-2

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