說到色譜，積分可是大事，今天我們就講講積分的故事…

在我們要對色譜峰進行積分計算之前，得先了解幾個概念：

定義

1、積分

指在信號中確定峰并計算其大小，積分包括以下操作及步驟：識別、校正、定量。

2、積分事件的參數控制

對于某個信號進行積分時，軟件將識別每個峰的開始和結束時間，并用豎線標記這些點，尋找每個峰的峰頂點，確定保留時間/遷移時間，建立基線，以及計算每個峰的峰面積、峰高和峰寬。這些過程積分事件的參數控制。

3、自動積分

自動積分功能為設置初始事件提供開始點。自動積分功能設置以下參數：初始斜率靈敏度（閾值）、初始峰高、初始峰寬、初始小峰面積。

4、手動積分

此類型的積分允許對選定的峰或峰組進行積分，在的手動積分范圍內，將忽略此軟件的事件積分（初始小峰面積除外）。如果手動積分出來的一個或多個峰低于小峰面積閾值，則此積分將被廢棄。手動積分時間使用時間值。它們不會為信號漂移作調整。

在報告中，手動積分提供以下功能：

§ 劃基線：為一個峰或一組峰劃基線的位置；

§ 負峰：何時將基線以下的面積當作負峰處理；

§ 切線撇去：計算從主峰切線撇去的峰面積；

§ 分裂峰：用垂線分裂峰的點；

§刪除峰：從積分結果中刪除一個或多個峰。

積分參數

自動積分主要是修改以下4個積分參數實現的，具體如下：

1、斜率靈敏度（Slope Sensitivity）

也稱閾值，指設置信號斜率的值，該斜率用于識別積分過程中峰的起點和終點。如何信號斜率大于“斜率靈敏度”值，將建立峰起點，如果信號斜率降到“斜率靈敏度”以下，將建立峰止點。

設置值越低，峰響應越靈敏，當然，不同品牌的儀器對設置值的響應程度會有所區別。

2、峰寬值（Peak Width）

用于控制積分器的選擇性以區分峰與基線噪音。如果設置的初始峰寬太小，則可能將噪音當作峰。如果寬峰與窄峰混在一起，可以選用運行時間編程事件設定特定的峰寬。

3、小峰面積值（Area Reject）

根據峰面積來設置小于目標峰面積的峰將不被積分也不會報告；

4、小峰高（Height Reject）

小目標峰的高度，任何小于小峰高的峰將不被積分及報告。

了解完概念，咱們說說如何進行積分計算？首先看一張圖：我在峰底下畫根線，這個線就是告訴軟件那個部分需要計入峰面積的計算。

我們說過，美圖軟件簡單好用容易上手，所以，大部分時候，我們的美圖軟件能自動幫我們畫線。

這就是說，我們的軟件能夠比較準確的指認出色譜峰，但是有些時候，軟件會犯傻，出現一些神作…

各位可能不知道，去韓國整容，大夫是要要先打草稿的，這一條條的線，就是草稿，草稿打的好，以后效果才好，所以，別小看這一堆線，這是成功的關鍵。

計算的效果如何，就全看這根線畫得準不準了，那么，這個線到底該怎么畫…

積分計算

首先，我們得知道到底怎么把一個“峰”認為是一個峰：

其實軟件看判斷峰是不是峰是有“套路”的，有一些指標的。靠一些數字閾值來確認的。各家軟件里一定都有，而且對各個參數的指認也有不同的算法和單位，都說出來太亂，而且估計大家也懶的看，總結了一下，軟件看峰的標準就是：

太陡了不積，太緩了也不積

太小了不積，太大了也不積

太矮了不積，太高了也不積

太胖了不積，太瘦了也不積

不讓積的時候，堅決不積

知道了這些套路，還怕啥子積分，當然，這還有什么其他用呢？

如果峰長得太丑，會不會給積分呢？當然不會，軟件不認啊，當然也不給積分了。

那如果，長得特別丑的峰被積分了，怎么辦？嘿嘿，你懂的，暗箱操作，改規矩唄...

修改規則這個事兒，在咱們的軟件里，叫做調整積分參數，目的就是讓咱們把那根線劃得剛剛好，讓想積分的峰積分上，這是一個很有技巧的事情，尤其是對于一些長相奇葩的峰，這條線怎么劃，就更是有學問了。對于這樣不太合格的峰，如果我們能調節參數讓積分線盡量能吧這些峰畫出來，那也就能勉強擠入選擇范圍了，這種修改積分規格的情況叫做，手動干預，當然，軟件越，劃線的手法也越厲害，比如上面的圖和下面的圖其實都是同一種情況，但是軟件如果厲害點，就會把直的積分線掰彎，讓面積計算更準點。

但可是，很多時候，我們不管怎么調，都找不出一個合適的組合將特別丑的峰積分，這個時候，該怎么辦？這個時候，我們就該用更深的套路了，那個特別丑的峰必須積分…強行在那個特別丑的峰上劃條線…這個行為，叫做“手動積分”，這是積分界的大殺器，它說積誰就積誰，就是這么霸氣。

雖然霸氣，但是麻煩也很多…尤其在法規實驗室這種監管森嚴的地界，一旦出現修改規則的事兒，要是沒有能讓人信服的理由，那事情可就鬧大了。

而管這個事的就是大名鼎鼎的FDA。

積分步驟

在軟件自動積分完成以后，如果根據我們數據處理方法中預設的積分參數得到的計算機過一切正常的話，皆大歡喜，分析完成出報告

如果，你發現了一點小問題，比如有些峰沒有被正確的積分出來，這個時候，我們就要走到第二個十字路口了，這些峰，到底是積還是不積…

到底該走哪邊，主要還是看峰沒有被正確積分的原因，

由于分離度或靈敏度低導致的峰沒有正確指認，

基線漂移導致的誤判，

保留時間微小變化導致的誤判，

峰型變化比如拖尾導致的誤判等。。。

當然，這些都是可能原因之一，具體什么原因，這需要各位根據自己實驗室的要求和方法的具體情況具體判斷，但是，有些情況是禁止的：

那就是好好的一個峰，但是非要亂劃線以使它能夠滿足系統適應性或者測試結果標準要求的情況。基本我們的數據的命運就決定了，被淘汰的，就要啟動實驗室調查了，而有些峰，還有一次機會被重新審查，進入手動積分階段，不過，到底是小改干預一下，還是要玩大的顛覆規則，那就要看峰自己的造化了

如果峰的毛病不大，只是暫時發揮失常，我們只要稍微調整下積分參數的設置就可以讓他們重回正常的積分狀態，那我們只需進行手動干預就可以

比如由于保留保留時間微小漂移的峰，我們可以適當調整時間窗口，或者是由于靈敏度問題的峰，我們可以適當調整峰高接受的閾值，他們就可以被正確積分。

但是有些峰，走型比較嚴重，比如比較嚴重的拖尾或者基線漂移，實在是超出了軟件自己解決問題的能力，那這個時候，我們只能親自操刀來劃那條線了，這個事情很重要，必須要親歷親為，小心謹慎。

這遍套路，聽著講下來，好像挺流暢，不過，好腦子不如爛筆頭，在實驗室里，一定要把套路記錄下來，形成自己門派的獨門秘籍，這個獨門秘籍，就是SOP，關于手動積分，如何判斷，如何使用，自己的實驗室里一定要結合自己的標準和情況制定一個SOP，這個SOP里一定要說明：

重新積分的原因，這是針對個十字路口的

允許重新積分的情況，這是針對第二個十字路口的，任何不滿足的這些情況的數據，不應該重新積分，而應該啟動實驗室調查。

重新積分使用的原理和方法

SOP猶如武功秘籍，不過接下來，要想練功，使用這個SOP，還得遵守一些江湖規矩：

重新積分的操作要經過相關權限人員管理者授權后才能進行，并且需要具有相應權限的人員進行操作，所以，進行手動積分操刀的，一定得是行家。

所有偏離SOP的偏差都應該在分析報告中討論，這叫亡羊補牢，避免下次走上同一條不歸路。

色譜積分參數和重新積分的情況，初始和終積分數據都應該在實驗室進行記錄并且經過復核，歸檔保存，這是為了留下證據，防止以后死無對證。

這么一看，要想搞定手動積分，還真是要花上不少心思，所以，建議就是：

與其潛心鉆研怎么搞好手動積分，寫好SOP，遵守規章制度，不如當初把方法做好一點，把可能分不好的峰都分開，峰型不好的給調好，選好合適的梯度和檢測波長減小基線漂移等等，這樣可以達到一勞永逸的效果。