隨著生活水平和醫(yī)療衛(wèi)生狀況的不斷提升，寄生蟲感染在我們?nèi)粘Ｉ钪兴坪跻讶諠u陌生。但在一些欠發(fā)達(dá)地區(qū)，由于貧困和不良的衛(wèi)生習(xí)慣造成的寄生蟲感染仍然威脅著無數(shù)生命。隱孢子蟲作為一種常見的人畜共患寄生蟲感染性疾病，是導(dǎo)致腹瀉病的主要原因。由于其經(jīng)由糞便傳播，所以常經(jīng)由水體污染而在衛(wèi)生條件較差的地區(qū)發(fā)生群體性感染。感染通常是自限性的，健康的成年人在發(fā)生階段的較嚴(yán)重的腹瀉之后便可恢復(fù)，但糞便仍可能具有傳染性。新生兒或免疫力低下的如艾滋病患者或經(jīng)免疫抑制治療的病人在感染后病情較嚴(yán)重，是兒童早期死亡、營(yíng)養(yǎng)不良和生長(zhǎng)遲緩的重要原因，也是艾滋病人并發(fā)腹瀉死亡的主要原因。

現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的隱孢子蟲共有15個(gè)亞種，分別感染人、家禽、寵物、牲畜以及一些野生動(dòng)物。由于不了解其致病機(jī)制，目前的治療方案往往是對(duì)癥用藥而非對(duì)因用藥。由于不同物種間感染模式差異，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(主要為牛等家畜)上應(yīng)對(duì)隱孢子蟲感染的有效疫苗往往對(duì)預(yù)防人的感染收效甚微。

針對(duì)以上問題，來自美國(guó)賓大獸醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種可用在小鼠模型中模擬與人患隱孢子蟲病相似病癥的隱孢子蟲(Cryptosporidium tyzzeri), 同時(shí)利用IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)幫助他們?cè)隗w研究隱孢子蟲的感染以及宿主經(jīng)寄生蟲或疫苗免疫激活后的抗感染現(xiàn)象。該研究于近期發(fā)表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。

要在小鼠體內(nèi)模擬人患隱孢子蟲病的合理模型，首先就需要找到相應(yīng)的隱孢子蟲。作者在農(nóng)場(chǎng)收集了大量小家鼠糞便，經(jīng)由測(cè)序，鑒定出一株與感染人的兩種隱孢子蟲(C. parvum和C. hominis)接近的一種鼠隱孢子蟲(C. tyzzeri)。同時(shí)為了后續(xù)在體觀察其感染模式以及宿主抗感染效果，作者通過CRISPR-Cas9技術(shù)將Luciferase基因和mCherry熒光蛋白導(dǎo)入到隱孢子蟲的基因組中，構(gòu)建了一株可以進(jìn)行活體以及顯微觀察的隱孢子蟲。

圖一C. tyzzeri的鑒定以及基因編輯 (上：隱孢子蟲種間基因組相似性比較，AB為常見感染人的兩種隱孢子蟲，C為常見感染鼠的隱孢子蟲)

構(gòu)建好的隱孢子蟲就可以進(jìn)行活體觀察了，由于有活力的隱孢子蟲可以表達(dá)Luciferase，在底物熒光素的作用下便可自發(fā)熒光，通過IVIS活體成像系統(tǒng)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)隱孢子蟲的繁殖情況。作者將這一光學(xué)觀察方式與傳統(tǒng)的糞便qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，二者具有很好的一致性。作者除了觀察到這一新鑒定的隱孢子蟲感染和人患隱孢子蟲病的感染部位以及病理表征一致之外，還觀察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隱孢子蟲的危害，這一點(diǎn)與臨床上免疫缺陷病人的高發(fā)病致死率也剛好吻合。

圖二  C. tyzzeri感染模式觀察

有了這一能夠很好模擬人隱孢子蟲感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之后，便可以利用這一模型進(jìn)行隱孢子蟲的治療以及疫苗的開發(fā)。由于臨床上隱孢子蟲高發(fā)地區(qū)人們?cè)诟腥?后再度感染的概率大大降低，因此作者首先檢驗(yàn)了蟲體是否可以直接作為疫苗來進(jìn)行感染的預(yù)防。利用未經(jīng)Luciferase標(biāo)記的C. tyzzeri進(jìn)行次感染，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組使用滅活的蟲體作為疫苗進(jìn)行次免疫，在感染后用廣譜抗蟲藥巴龍霉素殺滅后用Luc標(biāo)記C. tyzzeri進(jìn)行二次感染，能夠觀察到接觸活蟲的小鼠幾乎不會(huì)發(fā)生二次感染，而使用滅活蟲體作為疫苗無法激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)的抗感染作用。

圖三 使用滅活的C. tyzzeri無法預(yù)防感染

因此作者想到可以使用減毒的活蟲對(duì)宿主進(jìn)行次免疫。通過射線進(jìn)行寄生蟲減毒處理，可以降低其感染力至無害水平。在減毒活蟲感染后30天，在使用Luc標(biāo)記的C. tyzzeri進(jìn)行感染，能夠觀察到該方法與野生型活蟲二次感染模型有著相同的抗感染作用，說明減毒的疫苗是一種行之有效的預(yù)防隱孢子蟲感染的方式。但是由于要調(diào)動(dòng)自身免疫系統(tǒng)，這一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。

圖四 使用減毒疫苗可以有效對(duì)隱孢子蟲進(jìn)行預(yù)防

雖然這篇文章也并未真正解決隱孢子蟲的抗感染問題，但是構(gòu)建出針對(duì)這一寄生蟲病的實(shí)驗(yàn)小鼠模型已經(jīng)為后續(xù)的科研工作者嘗試更多治療方案和預(yù)防措施提供了可操作可監(jiān)控的實(shí)驗(yàn)工具。

參考文獻(xiàn)

1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00

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