節 免疫組化操作步驟及抗原修復（供參考）

一、免疫組化操作步驟
（一）、儀器設備
1、 18 cm 不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐
2、 水浴鍋
（二）、試 劑
1、 PBS 緩沖液（pH7.2―7.4） 吉試劑
2、 0.01mol/L 檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000 ml）
3、 3% 甲醇―H2O2 溶液：用 30% H2O2 和 80% 甲醇溶液配制
4、 風裱劑：
a. 甘油和 0.5 mmol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合
b. 油和 TBS（PBS）配制
5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標本；pH7.0-7.4 適合光學纖維標本
（三）、操作流程
1、 脫蠟和水化：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置 60 分鐘或 60℃ 恒溫箱中烘烤 20 分鐘
a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡 10 分鐘，更換二甲苯后在浸泡 10 分鐘
b. 無水乙醇中浸泡五分鐘
c. 95% 乙醇中浸泡五分鐘
d. 75% 乙醇中浸泡五分鐘
2、 抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片
二、抗原修復（免疫組化石蠟切片）
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復。
福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結構，蛋白多肽發生交聯，導致部分抗原表位封閉，結合位點減少，所以需要抗原修復，以暴露原來的抗原表位，達到充分顯露抗原，以不出現明顯脫片現象為佳。
抗原修復的幾種常用方法（供參考）
1、 微波爐加熱：
在微波爐里加熱 0.01 枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔 5-10 分鐘，反復 1-2 次。根據玻片情況可參考采用微波加熱「3-5-3 法」3 分鐘溫火沸騰后靜止 5 分鐘，再溫火沸騰 3 分鐘即可。
適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標本；來源于其他動物種屬的組織標本。
2、 沸熱修復：
電爐或水浴鍋加熱 0.01M 枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0） 95℃ 左右，放入組織芯片加熱 10-15 分鐘。
3、 高壓熱修復：
在沸水中加入 EDTA（pH8.0）或 0.01m 枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）. 蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10 分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（骨及軟骨組織的標本選擇較溫和的微波加熱修復）。
4、 酶消化方法：
常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱 37℃，消化時間約為 5-30 分鐘。
適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN. 等。
三、石蠟切片免疫組化染色步驟
1、三步法（以 SP 試劑盒為例）
 石蠟切片脫蠟水
 蒸餾水沖洗，PBS 浸泡 5 分鐘，如果采用抗原修復，可在此步后進行
- 3% H2O2 室溫孵育 5~10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
- 5~10% 正常山羊血清封閉，室溫孵育 10 分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃ 孵育 1~2 小時或 4℃ 過夜
-PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS 稀釋），37℃ 孵育 10~30 分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃ 或室溫孵育 10~20 分鐘
 PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS 稀釋），37℃ 孵育 10~30 分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 或室溫孵育 10~20 分鐘
 PBS 沖洗，2 分鐘×3 次
顯色劑顯色（DAB 或 AEC）--（DA1010 DAB 顯色試劑盒（20×））吉試劑
自來水充分沖洗，復染，脫水透明、封片
如果必要，可選用 avdin 封閉內源性生物素
2.SABC 法
脫蠟、水化
PBS 洗 2 次各 5 分鐘
用蒸餾水或 PBS 配制新鮮的 3% H2O2 ，室溫封閉 5-10 分鐘，用蒸餾水洗 3 次
抗原修復
PBS 洗 5 分鐘
滴加正常山羊血清封閉液，室溫 20 分鐘，甩去多余液體
滴加Ι抗 50ul, 室溫靜置 1 小時或 4℃ 過夜或 37℃1 小時
PBS 洗 3 次各 2 分鐘
滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20 分鐘
PBS 洗 3 次各 2 分鐘
滴加試劑 SABC 20℃-30℃ 20 分鐘
PBS 洗 4 次各 5 分鐘
DAB 顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
脫水、透明、封片、鏡檢
四、冰凍切片的免疫組化染色步驟
速凍組織
冰凍切片 4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內，或進行短暫預固定后儲存于-20℃ 冰箱
室溫放置 30 分鐘后，入 4℃ 丙酮固定 10 分鐘，也可根據需要選擇其他的固定方式
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次
用 3% 過氧化氫孵育 5~10 分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性
PBS 沖洗，5 分鐘×3 次
下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）
第二節 免疫組化抗原熱修復的技術要點（供參考）
一、抗原熱修復溫度和時間的關系
我們日常工作中所使用的組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內或蛋白之間的亞甲基發生橋連，具體過程如下：
步：基本反應福爾馬林和氫反應形成新的化合物；
第二步：基本反應福爾馬林和氫反應形成新的亞甲基橋。
上述反應的結果導致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復的兩個關鍵的因素是溫度和時間，有人將這兩種因素對抗原修復的影響總結為下面的公式： 抗原熱修復的有效性=加熱溫度（T）× 加熱時間（t）。
也就是說當我們修復時的溫度越低則需要修復的時間就越長；反過來當修復溫度增高時修復的時間可以適當地縮短，才能使抗原決定簇*暴露，這種反比的關系從 MBI 單克隆抗體的實驗結果「表 1」中也可以清楚地看出。

如果修復強度不夠，免疫組織化學染色所顯示的只能是修復后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結果可能會非常弱，或出現假陰性，即使是陽性結果，充其量只能起到定性的作用，不能適應今后對免疫組化進行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標的應用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標。
二、組織固定時間和所需的抗原熱修復的關系
大量的實驗表明，固定時間越長的標本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應增高，這可能就是我們對固定時間長的標本加大修復強度的理論基礎。
這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復條件，它與新鮮標本的修復條件一定是有所區別的，同等條件下一定要加長修復的時間或提高修復所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結果。
三、不同 pH 值抗原修復液對染色結果的影響
抗原熱修復中所使用的修復液 pH 值也會對染色結果產生相當大的影響。
pH 值對染色結果的影響大概可以分為以下四種情況：
A. 穩定型，pH 值對染色結果影響不大，如 PCNA、AE1、EMA、CD20 等；
B.V 型，高 pH 值和低 pH 值染色較好，而 pH 值 4-5 染色結果較差，如 ER、Ki-67 等；
C. 上升型，隨著 pH 值的增加，染色結果逐漸增強，如 HMB45 等；
D. 下降型，隨著 pH 值的增加染色結果逐漸減弱，當然這種類型的抗體只是個別的現象，如 MOC31。
一個有趣的現象值得注意，即在高 pH 值都有較好的染色結果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高 pH 值得修復液，如 1 mM EDTA, pH8.0 或 pH9.0 等。但是由于傳統習慣，絕大多數醫院和實驗室都在使用 pH6.0 的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規的免疫組化工作中，全部選用高 pH 值得修復液來代替目前廣為使用的 pH6.0 枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經推出 pH8.0 和 pH9.0 的新型抗原修復液。經驗證，絕大多數的抗體使用 pH9.0 得修復液效果都要優于 pH6.0 的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規的免疫組化工作中，使用高 pH 值的抗原修復液是今后的必然趨勢。