徠卡DM3000熒光顯微鏡用于熒光原位雜交（FISH)介紹

徠卡DM3000熒光顯微鏡用于熒光原位雜交（FISH)介紹

技術：

1、熒光原位雜交原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

2、熒光原位雜交特點

原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統則可克服這些不足，這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系，有以下特點。

熒光原位雜交優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全;2、探針穩定，一次標記后可在兩年內使用;3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當;5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

熒光原位雜交缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

3、熒光原位雜交實驗流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→(染色體顯帶)→熒光顯微鏡檢測→結果分析。

4、熒光原位雜交應用

熒光原位雜交技術不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。

熒光原位雜交技術初用于中期染色體。從正在分化的細胞核中制備的這種染色體是高度凝縮的，每條染色體都具有可識別的形態，它們染色后將顯現出特征性的著絲粒位置及染色帶型。在處理中期染色體時，通過測定FISH所獲得熒光信號相對于染色體短臂末端的位置(FLpter值)來進行作圖。使用中期染色體的不足之處在于，由于它的高度凝縮的性質，只能進行低分辨率作圖，兩個標記少分隔1Mb才能作為分開的雜交信號被分辨出來(Trask et al.，1991)。這種分辨率不足以構建有交往的染色體圖譜。故此中期染色體FISH主要用于確定新標記在染色體上的大概位置，為其他更精細的作圖方法做準備。 一直以來，這些“其他方法”并不包括任一種FISH，但1995年后，一系列高分辨率的FISH技術已發展起來。這些技術通過改變待研究的染色體制備的性質而達到較高的分辨率。中期染色體對于精細作圖來說凝縮度太高，因而我們需要選用較為伸展的染色體。有兩種途徑可以滿足這一要求(Heiskanen et al.，1996)： 機械伸展的染色體(mechanically stretched chromosome)通過改變從中期細胞核中分享染色體的方法而獲得。離心產生剪切力可將染色體伸展到正常長度20倍。每條染色體仍可識別，而FISH信號作圖方法與通常處理的中期染色體相同，這樣，分辨率可明顯提高，能夠區分出相隔200~300kb的標記。 非中期染色體(non-metaphase chromosome)染色體僅在中期高度凝縮，而在細胞周期的其他階段保持天然未包裝狀態，有研究者曾利用前期細胞核，此時染色體凝縮程度足以區分出單個染色體。實際應用中，這種方法并無優于機械伸展的染色體之處。相比之下分裂間期(interphase)的染色體更為有用，因為分裂間期(再次細胞核分裂之間)的染色體包裝程度低。使用分裂間期的染色體，分辨率有可能達到25kb以下，但染色體形態特征消失，推動了定位探針位置所需的外部參照點。因此，該技術可在已獲得染色體粗略圖譜后使用，通常作為確定染色體一段小區域內一系列標記物順序的方法。 間期染色體含有去組裝的全部的細胞DNA分子。為了進一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放棄完整的染色體，而使用純化的DNA。這種方法叫做纖維-FISH(fiber-FISH)，利用凝膠拉伸或分子梳理技術制備DNA，可以分辨間距小于10kb的標記。