簡介

在生物化學(xué)領(lǐng)域中，生物材料的熱學(xué)性能研究是材料分析的重要組成部分。而熔解溫度（T_M）是生物材料中應(yīng)用zui廣泛的熱學(xué)性能。生物材料由許多化學(xué)鍵組成，隨著溫度的升高，材料內(nèi)能增加同時化學(xué)鍵斷裂。這種因化學(xué)鍵斷裂而導(dǎo)致生物材料結(jié)構(gòu)改變的現(xiàn)象被稱作熱變性。此外，zui活躍時的變性溫度被稱為熔解溫度。熔解溫度是用于表征材料穩(wěn)定性的指標(biāo)之一。寡核苷酸是一種遺傳物質(zhì)，由多組堿基構(gòu)成。寡核苷酸可以很容易地和它們的互補(bǔ)對鏈接，所以常用來作為探針確定DNA或RNA的結(jié)構(gòu)，經(jīng)常用于基因芯片、電泳、熒光雜交等過程中。如圖1所示，我們將Alexa Fluor^® 488 熒光探針標(biāo)記在寡核苷酸的5´  端部，將Alexa Fluor^® 532 熒光探針連接在另一端。

本實驗采用Thermo Fisher公司的lumina熒光分光光度計配備 Peltier 溫控系統(tǒng)（圖2）對不同溫度下的熒光性能進(jìn)行了測量。Peltier溫控系統(tǒng)可快速地對溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，溫度范圍可控制在-10℃到100℃。該系統(tǒng)有樣品除霜功能、磁力攪拌功能和溫控功能。本研究采用 Lumina 和 Peltier系統(tǒng)，結(jié)合熒光標(biāo)記，研究了寡核苷酸熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系。zui終根據(jù)一階導(dǎo)數(shù)分析熔點曲線并計算出了T_M 值。

圖 2：Peltier 系統(tǒng)配件（單池池架（a）、4 聯(lián)池池架（b）、Peltier 控制模塊（c））

試劑和儀器

1.Lumina熒光分光光度計 

2.Peltier 控制模塊、單池池架

3.供體寡核苷酸5´  – (Alexa 488) – ACCGTGAGCA – 3´

4.受體寡核苷酸

5´ – (Alexa 532) – TGCTCACGGT – 3´ 5.Tris-EDTA 緩沖液（pH 8.0）

6.NaCl（ACS 試劑，≥99.0%）

7.10ml 塑料管

8.熒光比色皿

實驗步驟

1.添加 10ml 的 Tris-EDTA 緩沖液（pH 8.0）到兩根塑料管中，形成濃度分別為172mM（供體）190mM（受體）的NaCl溶液。

2.在上述緩沖液中溶解供體/受體寡核苷酸，使?jié)舛茸?/span>為900nM。

3.混合已制備的供體試劑和受體試劑，然后在室溫下培養(yǎng)5分鐘。

4.將Peltier系統(tǒng)安裝在 Lumina上。5.打開Luminous的Thermal軟件，如圖3輸入預(yù)定參數(shù)。使用軟件（Excel^®, Origin^®等）根據(jù)供體各測量點數(shù)據(jù)計算一階導(dǎo)數(shù)，并在測量后查看T_M 值。

儀器參數(shù)

圖3：Thermal軟件測量條件

實驗結(jié)果

FRET 現(xiàn)象是供體到受體的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，這是由于熒光物質(zhì)受熱前熒光探針間距離較短造成的。因

此，在供體激發(fā)波長519nm處發(fā)出較弱的熒光，在受體的激發(fā)波長553nm處發(fā)出較強(qiáng)的熒光。另一方面，

隨著受熱產(chǎn)生的熱變性現(xiàn)象，與FRET現(xiàn)象相反。換句話說，熒光在519nm時較強(qiáng)，而在553nm時較弱（圖4）。

圖4：受熱前（左圖，25℃）、受熱后（右圖，55℃）熱變性熒光強(qiáng)度如圖5所示，我們繪制了供體、受體熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系?？梢源_認(rèn)，供體和受體上發(fā)生的熒光強(qiáng)度逆轉(zhuǎn)的情況是由于 FRET 現(xiàn)象消失導(dǎo)致的。

圖5：供體、受體熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系

目前有多種方法可以確定T_M 值，本實驗中我們通過一階導(dǎo)數(shù)的峰值來確定T_M 值。本次試驗所用寡核苷酸的TM 值為49℃。（圖6）

圖6：熒光強(qiáng)度隨溫度而改變

實驗結(jié)論

本研究中，使用Thermo Fisher公司Lumina熒光分光光度計和Peltier 溫控系統(tǒng)，研究了溫度變化對寡核苷酸熒光強(qiáng)度的影響。此外，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算出代表材料安全性的TM 值。