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基因工程操作中涉及一系列相互關聯的酶促反應。已經知道有許多重要的核酸酶，如限制性內切核酸酶、外切核酸酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、反轉錄酶、DNA及RNA的修飾酶等，在基因工程的操作中有著廣泛的用途。
1．限制性內切核酸酶
限制性內切核酸酶（restrictionendonuclease）是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的條件下使每一條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產生具有3／—OH基團和5／—P基團的DNA片段的內切脫氧核糖核酸酶（endo-deoxyribonuclease）。至今發現的限制性內切核酸酶有I型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶，它們各具特性。基因工程中所說的限制性內切核酸酶都是指Ⅱ型酶。
限制性內切核酸酶把目的基因從只有四種堿基A、T、G、C組成的DNA長鏈（人類DNA長度為3X109個堿基對）中準確地剪切下來。每一種限制性內切核酸酶的識別位點是固定的，如EcoRI的識別位點是GAATTC及其互補序列CTTAAG。
1968年，沃納·阿爾伯博士、丹尼爾·內森斯博士和漢密爾·史密斯博士*次從大腸桿菌中提取出限制性內切核酸酶。該酶能夠在DNA上尋找到特異的“切點”，認準后將DNA分子的雙鏈交錯地切斷。至今人們已經分離提取出400多種限制性內切核酸酶。目前，人們可以從復雜的生物有機體基因組中，經過限制性內切核酸酶酶切消化等步驟，分離出目的基因。因其能夠特異地切割DNA分子，人們常形象的將其比作“分子剪刀”。
2．DNA連接酶
DNA連接酶能夠催化具有3／—OH基團和5／—P基團的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。在基因克隆中用來連接目的基因與載體。
3．DNA聚合酶
DNA聚合酶可以使單核苷酸通過磷酸二酯鍵加在寡核苷酸的3／—OH端，在基因克隆中用來補平缺口。尤其是具有耐熱性質的DNA聚合酶的分離極大促進了基因等DNA片段的體外合成與擴增技術的發展。
4．反轉錄酶
反轉錄酶以RNA為模板合成DNA，即eDNA（complementaryDNA，互補DNA）。在基因克隆中常用來構建eDNA文庫。
以上各種酶的發現和應用才使基因工程技術成為可能。
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