精子頂體形態花生凝集素熒光標記（PNA-FITC）染色試劑盒產品說明書

主要用途

精子頂體形態花生凝集素熒光標記（PNA-FITC）染色試劑是一種旨在使用熒光素標記的花生凝集素和赫斯特33258雙重熒光染色技術，分析生理性反應性或病理性退行性頂體缺失的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物或人體精子細胞以及凍存精子細胞，以及受精時的精子細胞。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩定，熒光清晰。

技術背景

在男科學（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎信息。其中精子的活力（vitality）、運動能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結構或染色質結構完整性（integrity）、頂體反應（acrosomal reaction）功能的評價是精子分析的重要指標，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數。其中頂體反應，是指當精子接近卵子實施授精時，精子頭部前半端的帽狀結構頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應測試是一項穩定的精子功能參數，可以用于預測受精成功率。因此頂體的結構完整性（intact）是評價的主要標志，也是不育癥和避免孕藥物研究的對象。使用熒光素標記的花生凝集素（Isothiocyano-fluoresceinated peanut Arachis hypogaea agglutinin；PNA-FITC）和赫斯特33258（Hoechst 33258）雙重熒光染色技術，是精子頂體反應分析和授精效率評價的常用的方法。首先使用赫斯特33258染色，分析精子活力，基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特點，受到活體精子細胞（包括游動性和非游動性精子）的排斥，而容易進入死亡精子細胞。其次使用熒光素標記的花生凝集素染料，與頂體外膜糖蛋白上的半乳糖殘基（β-D-galactosyl residue）的結合，顯示完整性（未反應性unreacted）頂體，同時可以應用于受精時的精卵反應。雙染的作用，以幫助區分生理性反應性頂體缺失（loss）或病理性退行性頂體缺失。通過常用的熒光顯微鏡（激發波長488nm，散發波長530nm）便可清晰觀察到綠色頂體狀態（status）。  

產品內容

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液A和B（Reagent B和E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

碘化丙啶：用于精子細胞染色

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品染色操作的容器

血細胞計數器：用于細胞計數

載玻片和蓋玻片：用于精子細胞爬片

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細胞

細胞流式儀：用于分析染色的精子細胞

實驗步驟

一、熒光顯微鏡分析

• 移取新鮮獲得的1毫升精液（48小時內）到1.5毫升離心管
• 放進37培養箱孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升保存液（Reagent A），混勻顆粒群
• 在血細胞計數器上進行精子細胞計數，并調整到2 × 10⁷精子細胞/毫升
• 移取100微升精子細胞到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升染色液A（Reagent B），混勻
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升清理液（Reagent C），混勻顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟12至14一次
• 加入xx微升保存液（Reagent A），混勻顆粒群
• 即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端
• 用蓋玻片或另一個載玻片推片
• 置于空氣中涼干
• 加上xx微升預冷的固著液（Reagent D），覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育1分鐘
• 小心抽去固著液
• 小心加上xx微升染色液B（Reagent E），覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 小心加上xx微升清理液（Reagent C），覆蓋樣品表面
• 小心抽去清理液
• 蓋上蓋玻片或封片液
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計數（注意：每個視野計數200個精子）

觀察藍色熒光—染色液A（Reagent B）：濾波器激發波長350nm，散發波長460nm ――可見藍色熒光，表明死亡精子細胞

觀察綠色熒光—染色液B（Reagent E）：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm ――可見綠色熒光，表明精子頂體區域

• 分析結果

• 細胞流式儀分析

• 移取新鮮獲得的1毫升精液（48小時內）到1.5毫升離心管
• 放進37培養箱孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升保存液（Reagent A），混勻顆粒群
• 在血細胞計數器上進行精子細胞計數，并調整到2 × 10⁷精子細胞/毫升
• 移取100微升精子細胞到新的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）加入xx微升染色液A（Reagent B），混勻
• （選擇步驟）室溫下孵育5分鐘，避免光照
• （選擇步驟）放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• （選擇步驟）加入xx微升清理液（Reagent C），混勻顆粒群
• （選擇步驟）放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx微升染色液B（Reagent B），混勻顆粒群
• 室溫下孵育20分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升用戶自備的碘化丙啶（propidium iodide；PI；0.4微克/毫升），混勻顆粒群
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟26至28一次
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
• 即刻進行細胞流式儀分析：觀察10000個細胞以上，200細胞/秒

• 三色標記細胞流式儀檢測參考圖像如下（X軸：FL2—綠色熒光；Y軸：FL3—紅色熒光）

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時須戴手套
• 樣品檢測前，建議在血細胞計數器上進行精子細胞計數
• 精子細胞計數時乘上稀釋倍數10⁴。標準血細胞計數器（Hemocytometer）的計算方法是：

1毫米方塊的細胞計數X 10⁴（稀釋倍數）＝實際細胞數/毫升

• 染色完成后，即刻進行檢測分析
• 用戶可以使用鈣離子載體A23187或Ionomycin誘導精子頂體缺失
• 用戶可以使用SYBR-14替代HOUCHST33258，進行細胞流式儀分析
• 通常使用PSA-FITC和PI雙染用于細胞流式儀分析
• 完整頂體（intact/whole acrosome）參考圖像如下：

• 頂體赤道部分（Equatorial segment）參考圖像如下：

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質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰