農(nóng)歷庚子年春節(jié)，“疫”軍突起，新型冠狀病毒（2019-nCoV）肆虐中華大地，全國上下正在面臨一場疫情阻擊戰(zhàn)。醫(yī)務(wù)工作者日以繼夜救治病患，科研人員加班加點(diǎn)投入到抗擊新冠病毒的相關(guān)研究中。
在病毒學(xué)研究中，病毒空斑實驗(virus plaque assay)將各稀釋度的病毒液接種到單層細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，吸附2小時后，在單層細(xì)胞上覆以瓊脂糖，病毒感染細(xì)胞并在細(xì)胞中增殖，使細(xì)胞破裂死亡。由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由初感染的細(xì)胞向四周擴(kuò)展。經(jīng)過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細(xì)胞區(qū)，即病毒空斑。理論上，當(dāng)病毒液充分稀釋后，獲得的每個空斑均源于初感染細(xì)胞的一個病毒顆粒。空斑實驗是病毒滴定，篩選病毒突變株，檢測病毒抗體和抗病毒藥物研究的常規(guī)手段。區(qū)別于傳統(tǒng)的只檢測病毒顆粒的PCR和免疫熒光方法，病毒空斑實驗檢測有活性的感染性病毒顆粒，即空斑形成數(shù)(PFU)。
目前，病毒空斑實驗主要還是通過人工計數(shù)的方式在6孔，12孔或24孔板里實現(xiàn)。這樣的操作速度慢，主觀因素大，出錯率高；尤其當(dāng)病毒活性比較高時，很難準(zhǔn)確統(tǒng)計出空斑數(shù)。
相比之下，利用成像配合自動計數(shù)的方法可以提高病毒空斑的檢測通量，提升計數(shù)的準(zhǔn)確性。如下圖所示，用AlexaFluor™ 488染色的病毒進(jìn)行空斑實驗，在病毒空斑形成后通過明場成像和熒光成像，可以看到感染后病毒引起宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變，也稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。這類效應(yīng)可能是或者細(xì)胞裂解導(dǎo)致單層（溶斑）出現(xiàn)孔洞(A)，也可能是形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞脫離（非溶斑）(B)。
利用模塊化的分析算法，計算機(jī)可以非常準(zhǔn)確地判斷出這兩種細(xì)胞病變狀態(tài)。如圖C中，紅色標(biāo)注的是溶斑空洞，而藍(lán)色的則是非溶斑的細(xì)胞脫離。
為了驗證計算機(jī)分析的準(zhǔn)確性，研究人員進(jìn)行了人工計數(shù)和計算機(jī)分析的比對實驗。將病毒按不同倍數(shù)進(jìn)行稀釋，進(jìn)行空斑實驗。實驗完成后，由3名分析人員進(jìn)行人工計數(shù)，同時利用EnSight™多模式檢測儀進(jìn)行成像和空斑計數(shù)分析（下圖）。
實驗結(jié)果顯示：人工計數(shù)和自動圖像分析都具有非常好的線性回歸，其R2值非常相似。但是當(dāng)病毒稀釋倍數(shù)很低（病毒濃度高）的時候，人工計數(shù)就很難實現(xiàn)了 ，如下圖中的1:20和1:10兩個病毒濃度點(diǎn)（圖D）。
從空斑計數(shù)結(jié)果看（圖E），第一次實驗在人工可計數(shù)的病毒濃度下，計算機(jī)分析和人工計數(shù)值基本一值；但第二次實驗中，在1:160和1:640兩個病毒濃度下，2號分析人員明顯高估了空斑的個數(shù)。這也說明人工計數(shù)存在一定的主觀性，具有計數(shù)值偏離真實值的風(fēng)險。
以上實驗是使用珀金埃爾默的EnSight™多模式檢測系統(tǒng)完成的。結(jié)果表明成像自動分析可以顯著提升病毒空斑實驗的通量以及實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
珀金埃爾默公司的EnSight™多模式檢測儀是一款集傳統(tǒng)酶標(biāo)技術(shù)和高速微孔成像于一體的系統(tǒng)。EnSight™成像模塊專為高速高效的細(xì)胞成像而設(shè)計，采用先進(jìn)的sCMOS相機(jī)以降低信號背景噪音，激光自動聚焦以快速成像，固態(tài)光源 (LED) 以進(jìn)行短時照明；配備高內(nèi)涵(HCS)圖像分析內(nèi)核的軟件Kaleido™，使圖像數(shù)據(jù)準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息。同時，EnSight™的Alpha和TR-FRET等模塊，可以在成像的同時檢測同一樣品中其他生化指標(biāo)，讓研究變得多維度，讓科研人員對實驗結(jié)果有更好的把握。
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