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摘 要
本文中展示了2024年9月中檢院單抗室最新發表在Electrophoresis 和 Journal of Chromatography A期刊上的兩篇文章[1-2]，分別對多個半胱氨酸偶聯的抗體-藥物偶聯物（cysteine-conjugated antibody-drug conjugate, cys-ADC）進行表征，尤其是電荷異質性分析的研究結果。
前 言
這兩篇文章均以cys-ADC作為研究對象。該類產品是通過一個可裂解的連接子將具有細胞毒性的藥物偶聯至單克隆抗體上，通過單克隆抗體精準識別靶細胞（通常為癌細胞）后，整個ADC分子被內吞進細胞，隨后連接子在胞內裂解，釋放出細胞毒性藥物，從而實現精準殺滅靶細胞的目的，同時最大程度上減小高細胞毒性藥物可能給病人帶來的副作用。對于本文中所討論的cys-ADC，在偶聯過程中，單抗輕重鏈間的二硫鍵被部分還原，暴露出的自由巰基用于小分子藥物偶聯，輕重鏈間僅靠非共價力相互結合，故能夠保持分子內非共價相互作用的非變性質譜（native MS）技術被廣泛應用在cys-ADC的表征中。
工作亮點
這兩篇文章的突出亮點在于成像等電聚焦毛細管電泳 (Imaged Capillary Isoelectric Focusing, icIEF)和非變性質譜技術聯用對于揭示cys-ADC電荷異質性的重要性。
對于cys-ADC產品，其單抗包含多種翻譯后修飾，如糖基化、脫酰胺和氧化等，再加上小分子藥物的偶聯，異質性極高，傳統的液質聯用技術對其電荷變異體的分離程度有限。而icIEF技術由于分離原理不同，可以從另一個角度對ADC進行最大程度上的電荷異質體分離，隨后使用基于Orbitrap平臺的高靈敏度非變性質譜技術對各個電荷異質峰進行在線完整蛋白分子量測定。
結果與討論
研究人員首先使用NISTmAb標準品進行了icIEF native MS方法開發，工作流程如圖1所示。Advanced Electrophoresis Solutions Ltd. （AES）公司的CEInfinite Automated Preparative icIEF System與Thermo Scientific™ Orbitrap™ Exploris™ 240 超高分辨質譜儀被用于icIEF native MS分析。該icIEF系統可同時實現分析型/直連型/離線餾分收集功能，與質譜直連非常靈活，不需要額外購買單獨的離子源接口。AEstyle系列兩性電解質可實現超高分辨率的電荷異質體分離，且對質譜的污染小。Orbitrap Exploris 240 超高分辨質譜儀的高靈敏度和高質量精度有助于發現并準確鑒定低豐度的組分，這一點對于非變性質譜條件下的完整分子量分析尤為關鍵，因為相較于變性質譜，非變性質譜條件下蛋白的帶電量減少，質譜響應降低。
圖1. icIEF native MS 整體工作流程
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圖2展示了使用 icIEF native MS流程對NISTmAb分析的icIEF-UV分離譜圖、質譜總離子流（TIC）圖和部分電荷異質峰的原始譜圖及解卷積結果。如圖2A所示，NISTmAb的電荷異質峰在icIEF層面上得到了分離，隨之被直連的質譜檢測到（圖2B）。從圖2C展示的主峰及部分酸/堿峰原始譜圖不難發現，對于高豐度的主峰和低豐度的酸/堿峰，均可在非變性條件下獲得高信噪比的原始譜圖，數據的高質量毋庸置疑。圖2D為圖2C中原始數據的解卷積結果，可見各個電荷異質峰中的組分均可得到解析，同時兼具高質量精度（主峰中A2G0F+A2G1F， 實測值與理論值質量偏差僅為0.9ppm）。更多詳細信息可參閱原文[1]。
圖2A. icIEF native MS條件下NISTmAb的icIEF-UV分離譜圖。（點擊查看大圖）
圖2B. icIEF native MS條件下NISTmAb的icIEF-MS質譜總離子流(TIC)圖。（點擊查看大圖）
圖2C. icIEF native MS條件下NISTmAb的主峰/酸峰1/堿峰3一級質譜圖。（點擊查看大圖）
圖2D. icIEF native MS條件下NISTmAb的主峰/酸峰1/堿峰3解卷積譜圖。（點擊查看大圖）
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圖3分別展示了使用 icIEF native MS流程對兩個cys-ADC 維迪西妥[2]和維泊妥珠[1]進行電荷異質性分析的結果。在icIEF層面上，兩個cys-ADC均得到了分離，隨后的native MS直連結果表明，兩個ADC電荷異質峰的分布略有差異，可能是由于兩個ADC分子各自的理化性質不同所導致的，進一步證明了ADC分子的復雜性和對其進行深入表征的必要性。詳細結果可參閱原文[1-2]。
本文所介紹的工作中，所使用的軟件也值得關注：Thermo Scientific™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) Software 被用于icIEF和Orbitrap超高分辨質譜平臺的儀器控制及數據采集[1]，為客戶的日常實驗提供了極大便利，同時也可以滿足客戶對于軟件合規性的需求。
圖3A. icIEF native MS條件下維迪西妥的icIEF-UV分離圖（左）和icIEF-MS質譜總離子流(TIC)圖（右）。
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圖 3B. icIEF native MS條件下維迪西妥各個電荷異質峰的解卷積圖。（點擊查看大圖）
圖3C. icIEF native MS條件下維泊妥珠的icIEF-UV分離圖（左）和icIEF-MS質譜總離子流(TIC)圖（右）。
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圖 3D. icIEF native MS條件下維泊妥珠各個電荷異質峰的解卷積圖。（點擊查看大圖）
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結論
本文所介紹的兩篇文章強調了創新型 icIEF-native MS 技術在 cys-ADC電荷異質性分析中的重要貢獻。該技術可被廣泛應用于具有非共價相互作用分子的電荷異質性分析中，提供全面的完整分子量信息用于組分鑒定。對于有合規需求的客戶，變色龍軟件的使用可滿足客戶要求。
原文參考鏈接：
[1] https://doi.org/10.1002/elps.202400083
[2] https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.465353
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