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杭州實了個驗生物科技有限公司
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瀏覽次數賽默飛熒光定量PCR儀使用方法
賽默飛熒光定量PCR儀（如 QuantStudio 系列、ABI 7500 系列）廣泛用于基因表達分析、病原體檢測、基因分型等實驗。以下是熒光定量PCR儀的標準操作方法，幫助您完成實驗。
1. 儀器操作前的準備
實驗設計
確定實驗目標：
基因表達定量、病原體檢測、SNP分析等。
選擇合適的試劑體系：
使用 TaqMan 探針、SYBR Green 染料或其他符合實驗需求的反應體系。
實驗材料準備
樣本模板（如 DNA、RNA 經過反轉錄的 cDNA）。
引物和探針（設計特異性高的引物和探針）。
PCR 反應試劑（如 Taq 酶、dNTPs）。
PCR 反應板（96孔或384孔，依儀器型號選擇）或 PCR 管。
無菌操作工具（如移液器、濾芯吸頭）。
檢查儀器狀態
確保熒光定量PCR儀已正確連接電源并開機。
檢查儀器是否校準，包括光學通道和溫控模塊。
清潔樣本托盤，避免污染。
2. 樣本和反應混合物的制備
標準 PCR 反應體系（以 20 µL 反應體系為例）：
| 成分 | 體積（µL） | 說明 |
|---|---|---|
| 樣本模板 | 1-2 | 根據實驗需求調整濃度和體積 |
| 引物對（10 µM） | 0.4-1.0 | 每對引物（正向和反向） |
| 探針或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探針或 SYBR Green 染料 |
| PCR 反應緩沖液 | 10 | 含 Mg2?、dNTPs 等 |
| Taq DNA 聚合酶 | 0.5 | 熱穩定酶，支持實時擴增 |
| 無核酸酶水 | 調至總量 20 µL | 確保反應體系最終體積正確 |
步驟：
在無菌環境下混合所有反應成分，輕輕振蕩均勻，避免氣泡產生。
將混合好的反應液分裝至 96 孔 PCR 板或 0.2 mL PCR 管中。
在每個孔/管上覆蓋光學透明封板或封膜，防止蒸發。
確保每孔的體積一致，以避免離心過程中不平衡。
3. 熒光定量PCR儀操作步驟
1. 啟動儀器
按儀器型號啟動，如 QuantStudio 系列或 ABI 7500 系列。
打開儀器配套軟件（如 QuantStudio Design and Analysis 軟件）。
2. 設置實驗參數
選擇實驗類型：
絕對定量實驗：檢測樣本中靶基因的絕對拷貝數。
相對定量實驗：研究靶基因在不同樣本中的表達水平。
溶解曲線分析：用于區分特異性擴增和非特異性擴增產物。
輸入實驗設計：
輸入靶基因和對照基因的信息。
熒光染料/探針類型（如 FAM、SYBR Green）。
選擇樣本板格式：
根據實驗需要選擇 96 孔板或 384 孔板。
設置每個孔的樣本名稱、反應成分和靶標信息。
設置 PCR 程序：
初始變性： 95°C，2 分鐘。
循環反應：
95°C，15 秒（變性）。
60°C，30-60 秒（退火和延伸），共 40-45 個循環。
標準熱循環程序：
如果是溶解曲線分析，加入升溫梯度（如從 60°C 升至 95°C）。
3. 加載樣本板
將已封裝好的 PCR 板或 PCR 管放入儀器樣本托盤。
確保板的擺放位置正確，并關閉樣本艙門。
4. 啟動運行
點擊軟件中的 "運行" 按鈕，啟動實驗程序。
儀器開始熱循環過程，同時采集熒光信號。
4. 數據分析和結果處理
1. 實時監測
儀器運行期間，可實時觀察熒光信號累積曲線，監控樣本擴增狀態。
2. 結果分析
擴增曲線：分析每個樣本的熒光信號累積曲線，判斷 Ct 值（循環閾值）。
Ct 值分析：
定量分析靶標的表達水平。
樣本濃度越高，Ct 值越低。
溶解曲線（SYBR Green 實驗）：判斷擴增產物的特異性。
標準曲線分析（絕對定量實驗）：根據標準品濃度繪制標準曲線，計算樣本濃度。
3. 數據導出
實驗完成后，通過軟件導出實驗數據（如擴增曲線圖、Ct 值表）。
數據可保存為 Excel、PDF 或其他格式，方便后續分析。
5. 儀器清潔與維護
樣本艙清潔：
每次實驗后，用無塵布輕輕擦拭樣本托盤，去除可能的污染物。
定期清潔光學模塊（如說明書所示），確保熒光檢測靈敏度。
軟件維護：
定期更新儀器和軟件至最新版本，獲取最新功能和性能優化。
校準與檢測：
定期校準儀器光學系統和溫控模塊，確保數據準確性。
如果儀器長期未使用，建議在正式實驗前進行性能驗證。
安全存儲：
關閉儀器電源，保持設備干燥。
防止樣本托盤接觸過高濕度或灰塵。
注意事項
樣本準備階段：
嚴格避免交叉污染。
使用無 RNA 酶、無 DNA 酶的耗材。
模板樣本濃度適中，過高會導致抑制擴增。
反應體系配置：
所有操作在冰上進行，防止酶降解。
確保所有反應組分混合均勻。
實驗運行階段：
不要隨意中斷儀器運行，避免影響實驗數據。
保證實驗室環境穩定，避免震動或電力波動。
總結
賽默飛熒光定量PCR儀的使用主要包括 樣本準備、反應體系配置、儀器參數設置、運行程序以及數據分析 等五個核心環節。嚴格按照操作規范可以有效提高實驗的成功率和數據的可靠性。實驗完成后，定期維護儀器可確保其長期穩定運行。
