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2022年12月22日，來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的Gene W. Yeo和Karen B. Chapman研究組合作在Nature Methods上以Brief Communication形式發(fā)表了題為Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP的文章，提出了一種新的抗體條形碼eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC）方法，極大提高了CLIP技術(shù)的便捷性和效率。

當(dāng)前CLIP技術(shù)無法大規(guī)模應(yīng)用主要存在兩個(gè)限制因素。第一，所有基于CLIP的方法都要先通過SDS-PAGE分離蛋白然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，依據(jù)分子量大小選擇免疫沉淀的蛋白-RNA復(fù)合物。這種人工切取蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物條帶的方法很繁瑣，需要額外的1.5-2天，并且容易受到操作者之間差異的影響。第二，每個(gè)單獨(dú)的RBP需要特定的免疫沉淀（IP）步驟，這對(duì)研究多個(gè)RBP所需的原始材料數(shù)量造成了負(fù)擔(dān)。針對(duì)以上兩個(gè)問題，研究團(tuán)隊(duì)人員通過加入DNA條形碼抗體，優(yōu)化了eCLIP的兩個(gè)限制，允許基于珠上近距離的連接（on-bead proximity-based ligations）取代SDS-PAGE和膜轉(zhuǎn)移步驟。此外，DNA條形碼還可以區(qū)分同一樣品中不同RBP，極大地降低了每個(gè)RBP的起始樣品量。研究人員將這種方法命名為抗體條形碼eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC），具體流程如下圖。

具體地，研究人員使用兩種特征明確的RBP評(píng)估抗體條形碼eCLIP新方法，分別是RNA結(jié)合Fox-1同源物2 （RBFOX2），它識(shí)別GCAUG基序，以及莖環(huán)結(jié)合蛋白（SLBP），它與組蛋白mRNA特異性相互作用。研究結(jié)果表明抗體條形碼eCLIP和常規(guī)eCLIP得到的結(jié)果基本一致，如下圖。這也驗(yàn)證了體條形碼eCLIP方法的可行性和準(zhǔn)確性。

抗體條形碼eCLIP的一個(gè)決定性優(yōu)勢(shì)是可以從單個(gè)樣本中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)RBP，因此研究人員在K562細(xì)胞中選擇了9個(gè)先前在ENCODE3中報(bào)道過的RBP，來展示基因區(qū)域內(nèi)已知結(jié)合位點(diǎn)的多樣性，其中包含5' UTR中的DDX3和EIF3G；3' UTR中的IGF2BP2、FAM120A、PUM2和ZC3H11A；CDS中的LIN28B；3'剪接位點(diǎn)的SF3B4和5'剪接位點(diǎn)下游的PRPF8。經(jīng)過比對(duì)分析表明抗體條形碼eCLIP和單獨(dú)eCLIP方法的檢測(cè)結(jié)果相似，見下圖。

綜上所述，研究人員提出了一種稱為抗體條形碼eCLIP的新方法，在使用單一eCLIP實(shí)驗(yàn)相同材料的基礎(chǔ)上，不僅簡(jiǎn)化了操作流程，同時(shí)也極大增加一次性檢測(cè)RBP的通量，這將有助于樣品來源稀少，且往往投入有限的臨床標(biāo)本檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

1. Ule, J., Jensen, K., Mele, A. & Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods 37, 376–386 (2005).

2. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L. & Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome-wide protein-RNA interactions. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 9, e1436 (2018).

3. Hafner, M. et al. CLIP and complementary methods. Nat. Rev. Methods Primers 1, 20 (2021).

4. Daniel L. et al. Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP. Nature Methods 20, 65–69 (2023).