熒光定量PCR儀的核心在于利用熒光信號來實時監測PCR過程中DNA或RNA樣本的擴增情況,從而實現對目標基因的精確定量分析。在熒光定量PCR中,首先需要將待測樣本與特異性引物、DNA聚合酶以及熒光基團或熒光標記的探針混合,形成一個反應體系。然后,通過設定特定的PCR程序,如退火溫度、延伸時間等,使得DNA在PCR儀中進行擴增。在PCR反應過程中,每當一個DNA被擴增時,與之結合的熒光基團或探針就會發出熒光信號。熒光定量PCR儀通過高靈敏度的熒光檢測系統,實時收集并分析這些熒光信號,將其轉化為數字信號,從而精確地反映出PCR產物的生成量。
一、操作步驟
打開電腦和熒光定量PCR儀的軟件,設置PCR儀各通道的光電倍增器(PMT)電壓。
將需要擴增的樣品模板、引物、探針和內參照熒光探針分別加入到樣品孔和試劑孔中。
加入PCR擴增試劑,包括緩沖液、引物、探針和內參照熒光探針。
啟動PCR擴增儀,設定循環參數,包括預變性、變性、復性、延伸和熒光檢測條件。
在每個循環中,加入相應的預變性液、復性液、延伸液和檢測液,并維持一定的時間。
每次循環結束后,PCR儀自動收集信號并進行數據分析。
經過多次循環后,PCR儀將自動停止運行并輸出結果。
二、維護保養
儀器外表應定期用軟布加少數清水擦洗,清洗后將儀器擦干。若有試劑泄漏在儀器外表,應使用軟布加70%酒精擦洗潔凈。
反應孔應定期清潔,一般3個月一次,可用吹氣球輕輕吹拭。為了防止塵土進入反應孔,儀器不使用時,應關閉滑蓋。若有試劑進入樣本孔內,應使用無塵軟布加70%酒精擦洗潔凈。
不要頻頻開關儀器,兩次開關間隔時間不得低于30秒。試驗結束后不要當即關閉電源,應待機10分鐘后再關閉電源。
應使用原廠商供應的電源線和通訊線,禁止在儀器上進行沸水浴或低溫保溫(如4℃)。
儀器裝有兩個10A保險絲,用以保護儀器。當保險絲發生損壞后,用戶應按說明書中的方法替換保險絲。
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