目錄:柏萊源（天津）生物科技有限公司>>生物試劑>>試劑盒kit>> HG-ZY002支原體DNA檢測試劑盒 qPCR-熒光探針法
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50 Reactions |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產業,制藥/生物制藥 |
貨號： HG-ZY002
支原體DNA檢測試劑盒可用于定性檢測主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞中是否存在支原體污染。本試劑盒利用熒光探針法qPCR技術，參照EP2.6.7和JPXVII支原體檢測相關要求進行驗證，可覆蓋100多種支原體，且與密切相關的菌種無交叉反應，檢測快速，在2h內可完成檢測工作，專一性強。
50 Reactions
| 序號 | 組分 | 規格 | 存儲條件 |
| 1 | 支原體Primer&Probe MIX | 120μL×1管 | -20℃及以下避光 |
| 2 | 2×qPCR Reaction MIX | 700μL×1管 | -20℃及以下 |
| 3 | 內控(Internal Control) | 220μL×1管 | |
| 4 | 陽性模板(Positive Control) | 500μL×1管 | |
| 5 | DNA稀釋液 | 1.5 mL×3管 |
• 試劑盒準備
將試劑盒各組分置于冰上或4℃，確保充分溶解開始操作。
• 需自備的耗材及設備
熒光定量PCR儀、渦旋儀、離心機
高精度移液器及一次性無菌無酶低吸附帶濾芯吸頭（0.1-2.5 µL、0.5-10 µL、10-100 µL、20-200 µL、100-1000 µL）
1.5 mL 無菌無酶低吸附離心管
無菌無酶八聯管或96孔qPCR板
建議使用譜新生物“支原體DNA樣本前處理試劑盒（HG-CL200）"提取樣本DNA。在加入樣本的同時，加入4 μL的內控（Internal Control）。提取樣本時，建議同步提取DNA稀釋液作為陰性對照。
2.1 根據所需檢測的參考品和待測樣品數量（一般做2-3組復孔），計算反應所需孔數：反應孔數=（1個無模板對照NTC+1個陽性對照PC+待測樣品）×復孔數
2.2 根據反應孔數計算本次所需的qPCR MIX總量：qPCR MIX =（ 反 應 孔 數 +2 或 3）×12.5 μL（2×qPCR Reaction MIX）+（ 反 應 孔 數 +2 或 3）×2.1 μL（ 支 原 體 Primer&Probe MIX）+（反應孔數+2或3）×0.4 μL（Internal Control）（2 或3為操作損失量）
2.3 將所用試劑置于冰上完i全溶解，輕微振蕩混勻，瞬時離心，按下表所示配制：
| 組分 | 單個反應量 |
| 2×qPCR Reaction MIX | 12.5 μL |
| 支原體 Primer&Probe MIX | 2.1 μL |
| 內控（Internal Control） | 0.4 μL |
| 總體積 | 15 μL |
【注】:如果在提取時已加入內控，則配制qPCR MIX時，用等體積的DNA稀釋液代替。
2.4 將配制的qPCR MIX，輕微振蕩混勻，瞬時離心，按15 μL/孔分裝至八聯管或者96孔板中。
2.5 將 DNA 稀釋液按10 μL/孔加到分裝了qPCR MIX八聯管或者96孔板中。
已融化未使用的DNA 稀釋液可在2-8℃短暫保存，若長期不使用，請儲存于-20℃。
3.1 將所需試劑置于冰上操作，輕微振蕩混勻，瞬時離心，加樣（總體積25 μL）：
| 陽性組 | 陽性模板各10 μL+所需qPCR MIX量15 μL |
| 陰性組 | DNA稀釋液各10 μL+所需qPCR MIX量15 μL |
| 實驗組 | 待測樣品各10 μL+所需qPCR MIX量15 μL |
3. 2 實驗可使用無菌無酶的八聯管或者96孔板進行反應，需去除反應體系中的氣泡，并離心至管底準備反應。
支原體檢測熒光基團選擇FAM，淬滅基團為None，內控熒光基團選擇CY5，淬滅基團為None，參比熒光為ROX（根據儀器要求選擇）。
反應程序：
| Stage1 | 污染消化 | Reps:1 | 37℃ | 2 min |
| Stage2 | 預變性 | Reps:1 | 95℃ | 30 s |
| Stage3 | 循環反應 | Reps:45 | 95℃ | 10s |
| 58℃ | 34s |
程序中58℃ 34 s處設置為熒光收集；反應體積25 μL。
| F A M 信 號 | CY5信號 | 判定結果 | |
| 陰性組 | CT≥40或無“S"型擴增曲線 | CT<40且有“S"型擴增曲線 | 陰性 |
| 陽性組 | CT<40且有“S"型擴增曲線 | CT<40且有“S"型擴增曲線 | 陽性 |
| 實驗組 | CT≥40或無“S"型擴增曲線 | CT<40且有“S"型擴增曲線 | 陰性 |
| CT≥40或無“S"型擴增曲線 | 有抑制 | ||
| CT<40且有“S"型擴增曲線 | CT<40且有“S"型擴增曲線 | 陽性 | |
| CT≥40或無“S"型擴增曲線 | 有抑制 |
1、本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2、陰性樣品（2×qPCR Reaction MIX、Primer&Probe MIX 和 DNA稀釋液等）和陽性樣品（PC和待測樣品等）的配制和加樣環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。
3、注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋，使用移液器移液時，需避免液體掛壁。
4、試劑盒必須在有效期內使用，不建議不同批次的相關試劑混用。
5、試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用，且需確保其充分溶解，各組分使用前需充分混勻，以保證試劑的均一性，經混勻的試劑需經短暫離心，以使管壁及蓋子上的液體全部集中于管底。若發現DNA稀釋液中有析出物，建議于 37 ℃條件下進行孵育，使DNA稀釋液完i全溶解。
6、只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測效果。
7、最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。
8、公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
9、本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。
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