實驗目的
1.掌握FISH技術的一般原理,及其基本實驗方法;
2.了解FISH技術的發展概況,以及應用范圍。
實驗原理
FISH是以分子雜交為基礎,應用非放射性熒光物質標記核酸探針,通過堿基互補的原理與靶DNA雜交,在核中或染色體上顯示靶DNA序列位置的方法。FISH技術可分為四個步驟:樣品制備、探針標記、雜交及其檢測。
實驗準備
1.材料染色體標本或血涂片
2.儀器低溫高速離心機、熒光顯微鏡、VELP漩渦混勻器、移液器、恒溫水浴鍋、培養箱、烤箱
實驗方法與步驟
1.探針混合與變性
(1)混合20~60ng標記探針DNA和3~5μg鮭精DNA。反應后體積少于10μl,可直接凍干;若體積較大,可加1/20體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積100%乙醇沉淀DNA。混勻并于-70℃30min。在4℃,12000r/min離心10min,棄上清,沉淀物以300μl70%乙醇洗滌后在離心(同上),棄上清,凍干。
(2)將DNA重懸于5μl去離子的甲酰胺中,室溫旋渦混勻3min。
(3)加入5μl雜交緩沖液,漩渦混勻器中混勻5min。
(4)將DNA探針置于75℃水浴中變性5min。迅速置于冰浴中5min,備用。
2.樣本處理
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