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PCR引物的設計
五、PCR引物的設計
（一）一般原則
1、引物長度在15～30堿基。引物過短，會使特異性降低。過長會提高相應的退火溫度，且合成引物的成本增加。
2、引物中堿基的分布是隨機的，避免4個以上的嘌呤或嘧啶的連續排列，G+C含量宜在
45～55％左右。
3、避免兩引物間的互補，特別是3‘端互補，以免形成二聚體。
4、引物自身不應存在連續超過3bp的互補序列， 否則引物自身會折疊成發夾結構或引物本身變性。
5、引物的3’端不能有任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。
6、引物的5’端限定著PCR產物的長度，可根據產物的要求不同， 可以選用不同的引物修飾法。
7、引物與非擴增序列的同源性不應超過70％。
（二）引物設計的方法
1、直接提交模板序列到特定網頁。
2、引物設計軟件。功能：首先是引物分析評價功能，其中以“Oligo 6"為優秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側重點不同。
六、PCR產物的檢測
（一）瓊脂糖凝膠電泳
是PCR擴增產物的分離、純化和鑒定常用的方法。其分辨率很高，可測出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的膠，800bp以下的片段用1.0%～2.0%的膠。
（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳
靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高，主要用于分離制備小于1kb長度的低分子質量基因片段，因此特別適用于合成的基因片段的分離和檢測。適用于PCR擴增效率低時產物的檢測。根據擴增片段的大小選擇合適的膠濃度，電泳后可用銀染或溴乙錠染色檢測，銀染比EB染色檢測靈敏度高2～10倍。
（三）層析技術
高效液相色譜(HPLC)是在常壓基礎上發展起來的一項現代化分析技術，其特點是分離速度快、效果好，是目前基因片段分離純化所廣泛采用的方法之一。
離子交換層析（ IEC ）的基礎是溶質分子所攜帶的電荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質。因此，IEC分析廣泛應用于DNA的合成及其擴增后的分離純化。
（四）分子雜交
為了確定PCR產物是否是預先設計的目的片段，或產物是否有突變，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括點雜交和Southern印跡雜交。點雜交靈敏度較高，特別適用于特異性不高的PCR擴增產物分析。
Southern印跡雜交可鑒定PCR產物的大小和特異性，檢測靈敏度可達10ng。基本過程是PCR產物進行常規的瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉移到尼龍膜上，再用標記的探針進行雜交檢測。
（五）限制性內切酶酶切分析
若知道PCR擴增片段的序列或限制性內切酶酶切圖譜，則可選擇合適的限制酶消化PCR產物，再進行電泳分析，根據PCR酶切產物的電泳圖譜，可判定PCR產物的特異性及是否存在突變。
（六）PCR擴增產物的直接測序
直接序列分析是指在PCR擴增基因組DNA序列的基礎上，直接進行基因核苷酸序列分析的方法，是檢測基因突變有效、直接的方法。
七、PCR中應注意的事項
（一）防止污染
試劑小量分裝
吸頭及Ep管一次性使用
器皿及工作區域要分開，無菌操作
（二）設立對照：
陽性對照：陽性模板
陰性對照：陰性模板
試劑對照：除模板外的所有組分