LDH 細(xì)胞毒性檢測試劑盒
MCE 國際站：Cytotoxicity LDH Assay Kit
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件： -20℃，避光保存，一年有效
簡介：MCE LDH Assay Kit 是通過分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測定細(xì)胞損傷的試劑盒。配合使用 CCK-8 (HY-K0301) 可獲得死細(xì)胞、活細(xì)胞數(shù)據(jù)。
概述：細(xì)胞死亡或膜損傷造成的細(xì)胞膜完整性喪失會導(dǎo)致胞漿內(nèi)酶的釋放，通過檢測釋放到培養(yǎng)液中的酶的活性可測定細(xì)胞毒性。乳酸脫氫酶（LDH）是細(xì)胞毒性研究中使用廣泛的標(biāo)志物之一，其存在于所有細(xì)胞類型中，并能在質(zhì)膜受損后迅速釋放到培養(yǎng)上清中。MCE LDH Assay Kit 是通過分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測定細(xì)胞損傷的試劑盒。在 LDH 的作用下，乳酸（Lactate）被氧化為丙酮酸（Pyruvate），NAD+被還原成 NADH，NADH 和 INT 反應(yīng)生成橙黃色的甲臜（Formazan）。甲臜的最大吸光度值位于 490 nm 處，且吸光度與 LDH 活性呈線性正相關(guān)。利用此原理可以測定死細(xì)胞和受損細(xì)胞的數(shù)量。本試劑盒對細(xì)胞無害，可直接添加到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，一步檢測培養(yǎng)上清中的 LDH 活（直接法），也可以分離細(xì)胞后吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測（間接法），分離的細(xì)胞可用于其他實驗。
描述：
由于細(xì)胞死亡或膜損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，導(dǎo)致某些可溶性胞漿酶釋放。因此，可以通過測量釋放到培養(yǎng)上清液中的這些酶的活性來測量急性細(xì)胞毒性。乳酸脫氫酶 (LDH) 是一種穩(wěn)定的酶，存在于所有細(xì)胞類型中，并在質(zhì)膜受損時迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中。因此，LDH 是細(xì)胞毒性研究中廣泛使用的標(biāo)記物。
LDH 氧化乳酸生成 NADH，然后與某些染料反應(yīng)生成黃色。生成顏色的強(qiáng)度與裂解的細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān)，這表明存在細(xì)胞毒性。LDH 活性可以通過分光光度計或平板讀數(shù)器在 490 nm 處輕松量化。
圖 1. MCE 細(xì)胞毒性 LDH 檢測試劑盒示意圖。
MCE 細(xì)胞毒性 LDH 檢測試劑盒可直接加入細(xì)胞中，檢測培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性（一步法，直接法）。或者您可以將培養(yǎng)上清液與細(xì)胞分離，然后使用此試劑盒檢測 LDH 活性（間接法）。分離的細(xì)胞可用于其他實驗。
圖2. 直接和間接法檢測LDH活性。
操作說明：1. 預(yù)實驗—確定 LDH 細(xì)胞毒性測定的最佳細(xì)胞數(shù)：1.1 先用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；1.2 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做 5-7 個細(xì)胞濃度梯度，每組 4-6 個復(fù)孔；1.3 接種后培養(yǎng) 2-4 h 使細(xì)胞貼壁；1.4 在高對照孔和高對照空白孔中加入 10 μL Lysis Solution，在低對照孔中加入 10 μL 培養(yǎng)基，37℃ CO 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 30 min；1.5 直接法：每孔吸掉 50 μL 培養(yǎng)基上清，以剩余培養(yǎng)基及細(xì)胞作為檢測對象，向每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻。1.5間接法：從每孔中吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻。注：直接法適用于不需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實驗，間接法適用于需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實驗。根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇其中一種方法測定 LDH 活性。1.6 室溫避光孵育 30 min1.7 在每孔加入 50 μL Stop Solution 后，立即用酶標(biāo)儀測定 490 nm 處的吸光度。2.5 注：根據(jù)如下要求選擇最佳的細(xì)胞濃度：2.5 a. 高對照孔和低對照孔的 OD 值之差 > 0.2；2.5 b. 在線性曲線上的該細(xì)胞濃度的 OD 值 < 2.0。2. 細(xì)胞毒性檢測：2.1 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔，104-105），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24 h；2.2 向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物；2.3 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育適當(dāng)時間（例如 6、12、24 或 48 h）；2.4 在高對照孔和高對照空白孔中加入 10 μL Lysis Solution，在低對照孔中加入 10 μL 培養(yǎng)基，37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 30 min；2.5 直接法：每孔吸掉 50 μL 培養(yǎng)基上清，以剩余培養(yǎng)基及細(xì)胞作為檢測對象，向每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；2.5 間接法：從每孔中吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；2.5 注：直接法適用于不需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實驗，間接法適用于需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實驗。根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇其中一種方法測定 LDH 活性。2.6 室溫避光孵育 30 min；2.7 在每孔加入 50 μL Stop Solution 后，立即用酶標(biāo)儀測定 490 nm 處的吸光度。2.5 注：配合使用 CCK-8（HY-K0301）可獲得死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)據(jù)
注意事項：1. 96 孔板的選擇：直接法中貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞都使用平底 96 孔板；間接法中貼壁細(xì)胞使用平底 96 孔板，懸浮細(xì)胞使用圓底或 V 底 96 孔板。2. 加入 Working Solution后，吸光度與反應(yīng)時間成正比，建議 0-30 min 內(nèi)檢測。由于不同細(xì)胞差異較大，建議第一次實驗時，分別測定 0 min，5 min，10 min，20 min，30 min 時的吸光度，以便確定最佳反應(yīng)時間。3. 使用 96 孔板進(jìn)行檢測時，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的 PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。4. 用酶標(biāo)儀檢測前需確保每孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。5. 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。6. 由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過 1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10% 血清，在檢測時一定要設(shè)置背景空白（僅含培養(yǎng)基），以用于消除背景。7. 細(xì)胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大等因素，都會造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。8. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
銷售產(chǎn)品：Meldonium | Phenylpyruvic acid | Fosinopril (sodium) | Dendrobine | GSK461364 | Desmosterol | Pyrazinamide | CYP3cide | iCRT 14 | (R)-Aminocarnitine
Trending products：Recombinant Proteins | Bioactive Screening Libraries | Natural Products | Dye Reagents | PROTAC | Isotope-Labeled Compounds
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