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酵母菌落PCR試劑盒(堿裂解法)

貨號：L7278

儲存條件：

-20oC保存，至少一年有效。

Yeast Lysis Buffer和Neutralization Buffer可以室溫或4oC保存，至少一年有效。

Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)盡量避免反復凍融。

產品組分：

產品描述

蘭博利德生產的酵母菌落PCR試劑盒(堿裂解法)是一種非常便捷的用于釀酒酵母、畢赤酵母等菌株在質粒轉化后陽性克隆菌落的PCR篩選和鑒定的試劑盒。本試劑盒提供了Yeast Lysis Buffer用于破壞酵母細胞壁，并提供了Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)用于進行PCR擴增。Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)是含有紫紅色和黃色染料(電泳位置分別約2.5kb和10bp)的2倍濃度的PCR預混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer等，用戶只需加入酵母菌落裂解液、引物和水即可進行PCR擴增，并且擴增完畢后可以直接上樣電泳。同時提供了Yeast Lysis Buffer在PCR反應前對酵母進行有效預處理，可以充分釋放酵母DNA，能確保有效進行酵母菌落PCR，從而大大縮短酵母轉化后陽性克隆鑒定的時間，提高實驗效率。

酵母細胞的細胞壁主要成分為多糖(85%-90%)和蛋白質(10%-15%)，其中多糖是由甘露聚糖、β-葡聚糖和少量的幾丁質等組成，處于細胞壁內層的β-葡聚糖與幾丁質共價相連，起到細胞骨架的作用；而外層的甘露聚糖與中層蛋白質中的絲*酸或蘇*酸以O-糖苷鍵相連接，形成的甘露糖蛋白覆蓋于細胞表面，給予酵母細胞一定的韌性。酵母細胞壁*特的結構致使其DNA難以被簡單的PCR加熱過程所釋放，導致很多將酵母直接作為模板進行PCR檢測的試劑盒成功率都比較低。

本試劑盒使用非常便捷。本試劑盒中提供的Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)已經含有所有的通用組分，用戶只需自備引物和水即可對酵母菌落進行PCR擴增。它大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導致的污染；同時Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)中已經包含了上樣緩沖液組分，PCR擴增結束后即可直接上樣電泳，無需添加上樣緩沖液。

本試劑盒中提供了雙色染料，便于電泳時觀察電泳進程。本試劑盒中的Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)加入了紫紅色和黃色的電泳示蹤染料(整體呈現紅色)，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置分別大約位于2.5kb和10bp處。PCR結束后可直接進行電泳檢測，無需再添加上樣緩沖液。紫紅色和黃色示蹤染料不會影響對相應DNA條帶的觀察和檢測。

使用方法：

1. 酵母菌落的裂解

a. 準備PCR管(例如蘭博利德生產的PCRG-1G 0.2ml優級PCR單管 )，每管中加入10μl Yeast Lysis Buffer。

b. 用無菌吸頭挑取0.2-1mm酵母單克隆至含10μl Yeast Lysis Buffer的PCR管中，吹打混勻或Vortex混勻，低速離心數秒使液體聚集在管底。同時對于該菌落進行標記或同時接種該菌落到液體培養基或新的平板上。

注：菌體過多可能會影響Yeast Lysis Buffer對酵母的裂解并影響后續PCR反應，菌體量通常不宜超過約2μl。

c. 在PCR儀上95oC加熱5分鐘，以充分釋放酵母的DNA。

d. 加入10μl Neutralization Buffer，混勻，后續即可作為DNA模板用于PCR檢測。

2. 酵母菌落PCR反應體系的設置：

a. 室溫融解Yeast Colony PCR Mix (Red, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數秒。

b. 參考下表在冰浴上設置PCR反應體系：

注：通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據情況在0.1-1.0μM范圍內調整引物的終濃度。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度。超純水可以選購D0055WJ（Lablead DNase/RNase-Free, Sterile Water）。

c. 吸取步驟1d準備好的DNA模板1μl至配制好的19μl PCR反應體系中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫低速離心數秒，使液體聚集在管底。

d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴石蠟油(M8410 Mineral oil)。

e. 把設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。

3. PCR反應參數的設置可以參考如下示例：

Step1(起始變性): 94oC 3min；Step2(變性): 94oC 30sec；Step3(退火): 55oC 30sec

Step4(延伸): 72oC 1min/kb；Step5(循環): Go To Step2 for 30 cycles；Step6(最終延伸): 72oC 10min

Step7(臨時保存): 4oC forever

注1：PCR反應的設置需根據模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同，設定不同的PCR反應條件包括溫度、時間和循環數等。

注2：Step4(延伸)的時間設置需根據PCR產物的長度進行設置，通常每kb產物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為1分鐘，PCR產物的長度為2kb，則延伸時間可以設置為2分鐘，以此類推。

注3：對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預期的PCR產物，可以把循環數設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應循環數一定要進行適當優化，使PCR反應沒有達到平臺期。

4. 結果檢測

PCR結束后直接取5-10μl進行電泳檢測，無需添加上樣緩沖液。

注意事項:

①酵母菌落較難裂解，裂解時請注意吹打混勻或Vortex震蕩混勻。

②由于PCR反應非常靈敏，可使目的基因擴增超過1000萬倍，在設置PCR反應時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。

③避免反復凍融本產品，多次反復凍融可能使產品性能下降。

④使用本產品前，一定要完*融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，并盡量避免產生氣泡。

⑤超純水推薦選購D0055WJ（Lablead DNase/RNase-Free, Sterile Water）。

⑥本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

⑦為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。