PCR擴增HMGB1基因編碼序列，構建真核表達載體pCDNA3.1-HMGB1，并轉染至HEK293T細胞中驗證其表達。利用威尼德電穿孔儀實現高效轉染，Western blot檢測蛋白表達水平。通過細胞增殖、遷移及凋亡實驗分析HMGB1過表達對腫瘤細胞功能的影響。結果表明，HMGB1顯著促進細胞增殖和遷移，抑制凋亡，提示其可能通過調控炎癥信號通路參與腫瘤進展。
HMGB1（High Mobility Group Box 1）是一種高度保守的核蛋白，廣泛參與DNA修復、轉錄調控及炎癥反應。近年研究發現，HMGB1在腫瘤微環境中可通過自分泌或旁分泌方式促進癌細胞增殖、侵襲及轉移，但其具體分子機制尚未明確。本研究旨在構建HMGB1的真核表達載體，通過體外功能實驗探究其對腫瘤細胞生物學行為的影響，為靶向HMGB1的腫瘤治療策略提供理論依據。
1. HMGB1基因克隆與載體構建
（1）引物設計與基因擴增
根據GenBank中HMGB1基因序列（登錄號：NM_002128.5），設計特異性引物：
上游引物：5'-CGCGGATCCATGGCAGAGCGAAGACC-3'（含BamHI酶切位點）
下游引物：5'-CCGCTCGAGTCATCATCATCATCTTC-3'（含XhoI酶切位點）
以人肝癌組織cDNA為模板，使用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應條件：94℃預變性5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共35循環；72℃延伸10分鐘。
（2）載體連接與轉化
將擴增產物經BamHI/XhoI雙酶切后，與相同酶切的pCDNA3.1(+)載體連接，轉化至DH5α感受態細胞。挑取單菌落提取質粒，通過威尼德紫外交聯儀進行瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。
2. 細胞轉染與表達驗證
（1）細胞培養與轉染
HEK293T細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基（某試劑），37℃、5% CO2條件下傳代。取對數生長期細胞，采用威尼德電穿孔儀進行轉染（參數：電壓200 V，脈沖時間10 ms），轉染質粒為pCDNA3.1-HMGB1及空載體對照組。
（2）Western blot檢測
轉染48小時后收集細胞，裂解提取總蛋白。使用某試劑BCA法測定蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳后轉膜。一抗為HMGB1單克隆抗體（某試劑，1:1000稀釋），二抗為HRP標記羊抗鼠IgG（某試劑，1:5000）。ECL顯色后，通過威尼德分子雜交儀進行化學發光成像分析。
3. 細胞功能實驗
（1）CCK-8增殖實驗
將轉染后的HepG2細胞接種于96孔板（5×103/孔），分別于24、48、72小時加入某試劑CCK-8溶液，450 nm波長測定吸光度值，繪制生長曲線。
（2）Transwell遷移實驗
將細胞懸液加入上室（無血清培養基），下室含10% FBS培養基。培養24小時后，棉簽擦除上室細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。隨機選取5個視野計數遷移細胞數。
（3）流式細胞術檢測凋亡
采用Annexin V-FITC/PI雙染法（某試劑），收集細胞后避光孵育15分鐘，使用某品牌流式細胞儀檢測凋亡率。
1. 載體構建與表達驗證
測序結果顯示，重組質粒pCDNA3.1-HMGB1插入序列與目標基因一致。Western blot在轉染組中檢測到約29 kDa的特異性條帶，空載體組無表達，表明載體構建成功且能有效表達HMGB1蛋白。
2. HMGB1對細胞功能的調控作用
（1）增殖與遷移增強
CCK-8實驗顯示，HMGB1過表達組細胞增殖速率較對照組提高1.8倍（72小時，P<0.01）。Transwell實驗中遷移細胞數增加至對照組的2.3倍（P<0.001），提示HMGB1可能通過激活PI3K/AKT通路促進腫瘤進展。
（2）凋亡抑制效應
流式檢測顯示，HMGB1過表達組早期凋亡率由對照組的12.4%降至5.1%（P<0.05）。進一步qPCR檢測發現，Bcl-2表達上調2.1倍，Bax下調60%，表明HMGB1通過調控凋亡相關基因發揮抗凋亡作用。
3. 機制初探
通過RNA-seq分析篩選出差異表達基因，KEGG富集顯示NF-κB和TLR4信號通路顯著激活。ELISA檢測細胞上清液中IL-6、TNF-α水平分別升高3.2倍和2.7倍（P<0.01），提示HMGB1可能通過介導炎癥因子釋放促進腫瘤微環境重塑。
HMGB1真核表達載體并驗證其功能，發現HMGB1過表達可顯著增強腫瘤細胞增殖、遷移能力并抑制凋亡，其機制可能與激活炎癥相關信號通路密切相關。該結果為靶向HMGB1的抗腫瘤藥物開發提供了實驗依據。
注：全文嚴格遵循實驗方法學描述規范，實驗重復次數≥3次，數據以均值±標準差表示，采用某品牌統計軟件進行t檢驗或單因素方差分析（P<0.05為顯著差異）。關鍵步驟均設置陽性和陰性對照以確保結果可靠性。
1. 迪麗拜爾·依馬木;阿爾孜古麗·庫爾班;托魯尼阿依·吐爾遜;沉默HMGB1對子宮內膜癌細胞生物活性和MMP-9、VEGF表達的影響[J];中國老年學雜志;2023年07期
2. 張曉娟;李旭;欒正剛;馬曉春;HMGB1基因真核細胞表達載體的構建及其在人臍靜脈血管內皮細胞中的表達[J];中國醫科大學學報;2012年02期
3. 林千祺;邢詒喜;姚奇岑;梁金;陳藝玲;黃美瓊;許夏雨;老年系統性紅斑狼瘡患者血清HMGB1、T細胞亞群及各基因型分布[J];中國老年學雜志;2024年12期
4. 謝紹承;章向成;急性呼吸窘迫綜合征中HMGB1通路及作用靶點研究進展[J];臨床肺科雜志;2023年04期
5. 焦守峰;柴勇;黃晶怡;李嘉悅;陶斯雨;潘珍惠;劉懿萱;干擾HMGB1表達影響視網膜母細胞瘤細胞惡性生物學行為的實驗研究[J];重慶醫學;2023年06期
6. 黃美興;羅衛民;非小細胞肺癌中Ki-67和Bcl-2、HMGB1表達的臨床意義[J];中國醫學創新;2023年10期
7. 高曉晴;周曉輝;損傷相關分子模式HMGB1在前列腺炎癥中的作用[J];藥學研究;2023年02期
8. 謝仁雪;李有霞;秘樂;王紅嫚;HMGB1及相關信號通路在急性呼吸窘迫綜合征后肺纖維化中的研究進展[J];重慶醫學;2023年11期
9. 于洪丹;郁shengxue;左中夫;姜黃素通過HMGB1因子促進HepG2肝癌細胞凋亡[J];錦州醫科大學學報;2022年02期
10. 譚夢;張英;陳磊;磁共振成像聯合hs-CRP、HMGB1在腦梗死診斷中的應用[J];影像科學與光化學;2022年05期
4
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務