摘要：本文詳細闡述了周期型馬來絲蟲多基因克隆構(gòu)建載體及轉(zhuǎn)染細胞的研究，通過RT-PCR技術(shù)擴增目標基因，構(gòu)建原核及真核表達載體，并轉(zhuǎn)染HeLa細胞進行表達分析。研究成功構(gòu)建了多基因轉(zhuǎn)化體系，為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
引言
馬來絲蟲（Brugia malayi）是一種寄生在人體淋巴系統(tǒng)中的絲蟲，可引起馬來絲蟲病。根據(jù)其微絲蚴出現(xiàn)于外周血液的時間，馬來絲蟲可分為夜現(xiàn)周期型和亞周期型。周期型馬來絲蟲成蟲寄生于人體四肢淺部淋巴系統(tǒng)，特別是下肢，導(dǎo)致急性淋巴結(jié)炎、淋巴管炎及象皮腫等癥狀。馬來絲蟲病的防治主要依賴于藥物治療，然而，藥物的副作用及抗藥性的出現(xiàn)使得疫苗研發(fā)變得尤為重要。
熱休克蛋白70（HSP70）作為一種重要的免疫原，在多種寄生蟲中均有表達，并顯示出良好的免疫保護效果。此外，馬來絲蟲M29編碼基因也被認為是一種潛在的疫苗候選分子。因此，克隆和表達這些基因，構(gòu)建其轉(zhuǎn)化體系，對于開發(fā)抗絲蟲感染疫苗及藥物具有重要意義。
本研究旨在克隆周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因，構(gòu)建原核及真核表達載體，并轉(zhuǎn)染HeLa細胞進行表達分析，從而為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)。通過多基因克隆及載體構(gòu)建，我們期望能夠篩選出高效表達的基因，進一步推進絲蟲病防治策略的發(fā)展。
材料與方法
1. 實驗材料
蟲體材料：周期型馬來絲蟲成蟲，由南通大學醫(yī)學院寄生蟲學教研室提供。
細胞系：HeLa細胞，購自ATCC細胞庫。
載體：原核表達載體pGEX-4T-3，真核表達載體pcDNA3.1（+），由實驗室保存。
試劑：某試劑RNA提取試劑盒、某試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒、某試劑PCR擴增試劑盒、某試劑DNA凝膠回收試劑盒、某試劑T4 DNA連接酶、某試劑質(zhì)粒提取試劑盒、某試劑限制性內(nèi)切酶、某試劑IPTG誘導(dǎo)劑、某試劑細胞培養(yǎng)基、某試劑轉(zhuǎn)染試劑。
儀器：某品牌臺式高速離心機、某品牌紫外可見分光光度計、某品牌高壓滅菌器、某品牌凝膠成像系統(tǒng)、某品牌PCR儀、某品牌水平電泳槽、某品牌電泳儀、某品牌恒溫培養(yǎng)箱、某品牌電熱恒溫鼓風干燥箱、某品牌恒溫水浴箱、某品牌旋渦振蕩器、某品牌超凈工作臺、威尼德電穿孔儀。
2. 實驗方法
2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
從周期型馬來絲蟲成蟲中提取總RNA，使用某試劑RNA提取試劑盒按照說明書操作。
將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用某試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書操作。
2.2 基因克隆及載體構(gòu)建
根據(jù)GenBank上公布的周期型馬來絲蟲HSP70基因（登錄號：M68933）及M29編碼基因的序列，設(shè)計引物。
使用某試劑PCR擴增試劑盒，以cDNA為模板擴增目的基因。
PCR產(chǎn)物經(jīng)某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測后，使用某試劑DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。
將目的片段與原核表達載體pGEX-4T-3及真核表達載體pcDNA3.1（+）分別進行雙酶切，使用某試劑限制性內(nèi)切酶，按照說明書操作。
使用某試劑T4 DNA連接酶將目的片段與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
挑取單克隆菌落，使用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進行雙酶切鑒定及測序驗證。
2.3 重組蛋白表達及鑒定
將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
挑取單克隆菌落，接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8。
加入IPTG誘導(dǎo)劑，37℃恒溫搖床繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
收集菌體，使用SDS-PAGE進行蛋白表達分析，使用某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達情況。
2.4 細胞轉(zhuǎn)染及表達分析
將HeLa細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞密度達到70%-80%。
使用某試劑轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書操作，將構(gòu)建成功的真核表達載體轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中。
轉(zhuǎn)染后48小時，收集細胞，使用SDS-PAGE進行蛋白表達分析，使用某品牌凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達情況。
實驗結(jié)果
1. 基因克隆及載體構(gòu)建
成功克隆了周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因，并構(gòu)建了原核表達載體pGEX-4T-3-HSP70、pGEX-4T-3-M29及真核表達載體pcDNA3.1（+）-HSP70、pcDNA3.1（+）-M29。雙酶切鑒定及測序驗證結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒符合預(yù)期大小，且序列正確。
2. 重組蛋白表達及鑒定
在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達了重組蛋白GST-HSP70及GST-M29，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組出現(xiàn)特異性蛋白表達條帶，與預(yù)計大小相符。目的蛋白占菌體總蛋白的10%-15%。
3. 細胞轉(zhuǎn)染及表達分析
成功將真核表達載體pcDNA3.1（+）-HSP70及pcDNA3.1（+）-M29轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)特異性蛋白表達條帶，與預(yù)計大小相符。目的蛋白在HeLa細胞中成功表達。
討論
本研究成功構(gòu)建了周期型馬來絲蟲HSP70基因及M29編碼基因的原核及真核表達載體，并實現(xiàn)了在大腸桿菌及HeLa細胞中的高效表達。這一研究為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
1. 基因克隆及載體構(gòu)建策略
在基因克隆及載體構(gòu)建過程中，我們選擇了常用的EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，以確保目的片段與載體的正確連接。同時，通過測序驗證確保了構(gòu)建的重組質(zhì)粒序列正確，為后續(xù)實驗提供了可靠的基礎(chǔ)。
2. 重組蛋白表達及鑒定
在大腸桿菌中表達重組蛋白時，我們選擇了IPTG誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達，并通過SDS-PAGE分析鑒定了目的蛋白的表達情況。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定表達目的蛋白，且表達量較高。這一結(jié)果為后續(xù)純化及功能研究提供了基礎(chǔ)。
3. 細胞轉(zhuǎn)染及表達分析
在細胞轉(zhuǎn)染實驗中，我們選擇了常用的某試劑轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，并通過SDS-PAGE分析鑒定了目的蛋白在HeLa細胞中的表達情況。結(jié)果表明，構(gòu)建的真核表達載體能夠成功轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中，并表達目的蛋白。這一結(jié)果為后續(xù)免疫學研究及疫苗研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景
本研究的創(chuàng)新之處在于成功構(gòu)建了周期型馬來絲蟲多基因克隆轉(zhuǎn)化體系，并實現(xiàn)了在大腸桿菌及HeLa細胞中的高效表達。這一研究為絲蟲病疫苗及抗蟲藥物的研發(fā)提供了新的思路和方法。未來，我們將進一步開展免疫學研究，評估目的蛋白的免疫保護效果，為絲蟲病防治策略的發(fā)展提供科學依據(jù)。
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