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摘要

本文詳細(xì)闡述了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF重組卡介苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究。通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ADF基因，并克隆至卡介苗表達(dá)載體中，構(gòu)建了重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組卡介苗通過(guò)滴鼻免疫方式具有顯著的抗球蟲(chóng)效果，為雞球蟲(chóng)病的預(yù)防提供了新的策略。

引言

雞球蟲(chóng)病是一種由艾美耳屬球蟲(chóng)寄生在雞的腸道引起的寄生性原蟲(chóng)病，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）是最主要的病原體之一。該病分布廣泛，感染率高達(dá)60%～70%，死亡率可超過(guò)80%，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，預(yù)防和治療雞球蟲(chóng)病的主要措施是使用化學(xué)藥物和抗球蟲(chóng)疫苗。然而，藥物殘留問(wèn)題和對(duì)環(huán)境的污染限制了化學(xué)藥物的使用，而現(xiàn)有的疫苗免疫效果并不理想。因此，開(kāi)發(fā)新型高效的疫苗成為雞球蟲(chóng)病防控的重要研究方向。

重組卡介苗（rBCG）作為一種致弱的活疫苗，具有較強(qiáng)的免疫佐劑作用，是表達(dá)外源基因的理想活菌疫苗載體。ADF（Actin Depolymerizing Factor）蛋白與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵雞的腸上皮細(xì)胞有關(guān)，可以結(jié)合肌動(dòng)蛋白，是潛在的疫苗候選抗原。本研究旨在構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF基因重組卡介苗，并評(píng)估其免疫保護(hù)效果，為雞球蟲(chóng)病的預(yù)防提供新的策略。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌DH5α、卡介苗BCG、穿梭表達(dá)載體pMV261和整合表達(dá)載體pMV361。

• 試劑：某品牌RNA提取試劑、某品牌RT-PCR試劑盒、某品牌限制性內(nèi)切酶、某品牌T4 DNA連接酶、某品牌質(zhì)粒提取試劑盒、某品牌IPTG、某品牌SDS-PAGE試劑盒等。

• 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雛雞。

2. 方法

• ADF基因的克隆：從柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊中提取總RNA，使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ADF基因的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），并克隆至pMD18-T載體中，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

• 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將ADF基因分別克隆至穿梭表達(dá)載體pMV261和整合表達(dá)載體pMV361中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ADF和pMV361-ADF。使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

• 重組卡介苗的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至卡介苗BCG中，篩選陽(yáng)性重組卡介苗。

• 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)：將構(gòu)建的重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通過(guò)滴鼻、口服、頸部皮下注射三種途徑接種SPF級(jí)雛雞，BCG免疫組作為對(duì)照。免疫后經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊，觀察并記錄雞的發(fā)病情況、盲腸病變、卵囊產(chǎn)量等指標(biāo)。

• 免疫效果評(píng)價(jià)：通過(guò)抗球蟲(chóng)指數(shù)（ACI）評(píng)價(jià)重組卡介苗疫苗的保護(hù)效果。同時(shí)，取免疫雞的血清用ELISA方法檢測(cè)抗體水平，取雞的脾臟測(cè)定脾淋巴細(xì)胞內(nèi)CD4+T、CD8+T細(xì)胞的百分率變化情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. ADF基因的克隆與測(cè)序

   成功從柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊中擴(kuò)增出ADF基因的完整ORF，大小為357bp，編碼118個(gè)氨基酸。測(cè)序結(jié)果與已報(bào)道的序列完整一致，說(shuō)明ADF基因在不同種和不同地理株間均具有高度的保守性。

2. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

   成功將ADF基因克隆至穿梭表達(dá)載體pMV261和整合表達(dá)載體pMV361中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ADF和pMV361-ADF。測(cè)序結(jié)果顯示，ADF基因正確插入載體中，且載體序列完整無(wú)誤。

3. 重組卡介苗的構(gòu)建與篩選

   成功將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至卡介苗BCG中，篩選獲得陽(yáng)性重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF。通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)ADF基因已正確整合至卡介苗基因組中。

4. 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)與免疫效果評(píng)價(jià)

   將構(gòu)建的重組卡介苗通過(guò)滴鼻、口服、頸部皮下注射三種途徑接種SPF級(jí)雛雞。結(jié)果顯示，滴鼻免疫方式的抗球蟲(chóng)效果好。重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF的ACI值分別為161.47和169.21，顯著高于BCG免疫組（P<0.01）。同時(shí)，免疫雞的抗體水平顯著升高，CD4+T淋巴細(xì)胞的百分率也顯著增加（P<0.01）。

   為進(jìn)一步驗(yàn)證IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強(qiáng)作用，將雞的IL-2基因與ADF基因同時(shí)克隆入載體中，制備兩株重組卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2。體外試驗(yàn)表明，滴鼻方式免疫pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2的抗球蟲(chóng)指數(shù)ACI可達(dá)到176.08和172.89，其抗體水平和CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分率與對(duì)照組相比差異均極顯著（P<0.01）。

討論

1. ADF基因作為疫苗候選抗原的潛力

   ADF蛋白與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)入侵雞的腸上皮細(xì)胞有關(guān)，是潛在的疫苗候選抗原。本研究成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF基因重組卡介苗，并通過(guò)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其顯著的抗球蟲(chóng)效果。這表明ADF基因作為疫苗候選抗原具有巨大的潛力。

2. 重組卡介苗的免疫佐劑作用

   重組卡介苗作為一種致弱的活疫苗，具有較強(qiáng)的免疫佐劑作用。本研究中，重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF通過(guò)滴鼻免疫方式顯著提高了雞的抗球蟲(chóng)指數(shù)，抗體水平和CD4+T淋巴細(xì)胞的百分率也顯著增加。這表明重組卡介苗在雞球蟲(chóng)病預(yù)防中具有顯著的免疫佐劑作用。

3. IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強(qiáng)作用

   IL-2是細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)（CMI）的主要細(xì)胞因子，由TH-1型細(xì)胞產(chǎn)生。本研究中將雞的IL-2基因與ADF基因同時(shí)克隆入載體中，制備了兩株重組卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2。結(jié)果顯示，IL-2基因能顯著提高重組卡介苗的抗球蟲(chóng)指數(shù)、抗體水平和CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分率。這表明IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗的免疫效果具有顯著的增強(qiáng)作用。

4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

   本研究構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF基因重組卡介苗，并評(píng)估了其免疫保護(hù)效果。通過(guò)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其顯著的抗球蟲(chóng)效果，為雞球蟲(chóng)病的預(yù)防提供了新的策略。同時(shí)，本研究還探討了IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強(qiáng)作用，為進(jìn)一步優(yōu)化疫苗提供了新思路。未來(lái)，本研究成果有望應(yīng)用于雞球蟲(chóng)病的防控實(shí)踐中，為養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展提供有力保障。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ADF基因重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF，并通過(guò)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其顯著的抗球蟲(chóng)效果。同時(shí)，本研究還探討了IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強(qiáng)作用。結(jié)果表明，ADF基因作為疫苗候選抗原具有巨大的潛力，重組卡介苗在雞球蟲(chóng)病預(yù)防中具有顯著的免疫佐劑作用，IL-2基因能顯著提高重組卡介苗的免疫效果。本研究為雞球蟲(chóng)病的預(yù)防提供了新的策略，為養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展提供了有力保障。未來(lái)，將進(jìn)一步優(yōu)化疫苗制備工藝，提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果，為雞球蟲(chóng)病的防控實(shí)踐提供更為有效的解決方案。