一、抗原修復技術
原理：通過高溫（熱修復）或蛋白酶K處理，破壞交聯鍵，暴露被封閉的抗原表位。
方法：
熱修復：將切片浸入pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱至95℃維持15分鐘。
酶消化：使用0.05%-0.1%胰蛋白酶37℃處理10-30分鐘（適用于疏松組織）。
二、優化固定條件
固定劑選擇：
固定劑 | 適用染色類型 | 缺點 |
4%多聚甲醛 | 常規免疫組化 | 強交聯，需抗原修復 |
乙醇/丙酮 | 細胞涂片、冰凍切片 | 穿透力差，易致細胞收縮 |
鋅鹽固定液 | 磷酸化蛋白保留 | 成本高，保存期短 |
固定時間控制：
小塊組織（<5mm3）固定不超過24小時，避免過度交聯。
三、穿透增強處理
去垢劑應用：0.1%-0.3% Triton X-100處理10分鐘，增加細胞膜通透性。
凍融循環：將組織反復凍融（-80℃?室溫），破壞致密結構（慎用于脆弱樣本）。
四、封閉內源性干擾物
內源性過氧化物酶：3% H?O?室溫處理10分鐘。
自發熒光：0.1% Sudan Black B乙醇溶液浸泡10分鐘（適用于醛基固定樣本）。
五、試劑與染色方案適配
抗體驗證：選擇經固定組織驗證的一抗（查閱文獻或說明書標注“IHC/IF validated"）。
染料適配：
核酸染料：優先選用抗固定型染料（如DAPI替代Hoechst）。
熒光標記：避免使用與自發熒光波長重疊的探針（如Cy5替代FITC）。
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