1.基線設置?：實時PCR反應的基線是指在PCR的初始循環(huán)期間的信號水平，通常是3至15個循環(huán)之間，此時熒光信號幾乎沒有變化，可以認為是背景或反應的噪音。
2. ?閾值設定?：?qPCR的閾值代表的是明顯超出基線的擴增信號水平，用以區(qū)分明確的擴增信號和背景。通常qPCR儀器自帶軟件會自動將閾值設置為基線熒光值標準偏差的10倍。
3. ?CT值計算?：Ct是指熒光信號超過閾值時對應的循環(huán)數(shù)，Ct值與目的基因的起始量成反比，可用于計算DNA初始拷貝數(shù)。
4. ?擴增曲線分析?：擴增曲線有兩種展現(xiàn)形式，一種是線性，一種是對數(shù)形式。通常用CT來推算樣品中樣品的濃度，CT值越高說明模板濃度越低。
5. ?標準曲線?：將已知濃度的樣品（標準品）經過梯度稀釋后分別取樣進行熒光定量PCR，得到的一系列Ct值與Log模板數(shù)對應可以得到一個相關的曲線，即標準曲線。這個標準曲線可以用來判斷熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。
6. ?熔解曲線分析?：PCR產物進行逐步升溫監(jiān)測，可以看到在達到其解鏈溫度時，熒光信號會有一個忽然的下降。理論上如果PCR得到特異性產物則只有一個Tm值，在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰，可以判斷產物不是單一的，發(fā)生了非特異擴增。
1. ?第一代PCR技術?：采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產物進行分析，通過電泳判斷擴增產物的大小，用于臨床檢測。
2. ?第二代PCR技術?：熒光定量PCR（qPCR），通過設置基線、閾值和CT值進行定量分析，適用于需要精確測量DNA或RNA含量的實驗。
3. ?第三代PCR技術?：以微滴化處理步驟為主要特征，提高了檢測的靈敏度和特異性，適用于更復雜的實驗需求。
三、具體實驗操作步驟
1. ?樣品處理?：將樣品進行稀釋和離心處理，確保DNAwanquan裂解和分離。
2. ?PCR反應?：按照試劑盒說明書操作，將反應管與凍干成分一起離心，添加緩沖液和引物/探針/核苷酸混合物，進行PCR反應。
3. ?結果分析?：通過基線、閾值、CT值和擴增曲線等參數(shù)分析PCR結果，比較實驗組和對照組的差異，確定基因表達的變化。
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