1. 預(yù)期用途

該面板包括八個單獨編碼的安瓿，每個安瓿都含有從人類細胞系中提取的冷凍干燥、純化的基因組 DNA (gDNA)。該面板包括七種材料，每種材料具有不同的 KRAS 密碼子 12 或 13 基因型、共有突變百分比和共有突變體以及每個二倍體人類基因組質(zhì)量的總 KRAS 拷貝數(shù)。此外，該組包含七個 KRAS 密碼子 12 和 13 基因型中的每一個的 gDNA 純合野生型材料（材料代碼 16/266）。攜帶感興趣的 KRAS 突變的材料可以通過應(yīng)用特定于每種材料的計算來稀釋，以產(chǎn)生一系列 KRAS 共有突變百分比的標(biāo)準(zhǔn)。該面板旨在用作校準(zhǔn)二級標(biāo)準(zhǔn)、試劑盒和測定的主要標(biāo)準(zhǔn)。這些材料不用作運行控制。

NIBSC 16/250基因組KRAS密碼子1213突變標(biāo)準(zhǔn)  由外部實驗室測試，并顯示適合作為下一代測序 (NGS)、Sanger 測序、實時 PCR、焦磷酸測序、數(shù)字 PCR (dPCR)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間 (MALDI- TOF) 質(zhì)譜分析 (MassARRAY®)、KRAS StripAssay®、高分辨率熔解分析 (HRM)、擴增難治突變系統(tǒng) PCR (ARMS-PCR)、PCR-反向序列特異性寡核苷酸探針技術(shù) (PCR-rSSO)、微測序和限制片段長度多態(tài)性分析（RFLP）。該小組由世界衛(wèi)生組織 (WHO) 生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會于 2017 年成立，作為 WHO 第一個基因組 KRAS 密碼子 12 和 13 突變國際參考小組，NIBSC 代碼 16/2501.這些材料不得用于任何其他用途。數(shù)據(jù)分析必須專注于 KRAS。不得嘗試識別源材料捐助者。

2. 注意

該制劑不適用于人類食物鏈中的人類或動物

對用于制備該組的細胞系進行了測試，通過 PCR 發(fā)現(xiàn) HIV1、HTLV1、HBV 和 HCV 呈陰性。在小組的制備中使用了一種 Epstein Barr 病毒 (EBV) 轉(zhuǎn)化的類淋巴母細胞系。 EBV 是英國危險病原體咨詢委員會分類的第 2 類病原體。 EBV 序列可能存在于這些材料中，但 DNA 是使用蛋白質(zhì)變性和去除的方案制備的，因此可能使病毒失活。

但是，不能消除活病毒存活的可能性。與所有生物來源的材料一樣，這種制劑應(yīng)被視為對健康有潛在危害。應(yīng)根據(jù)您自己實驗室的安全程序使用和丟棄它。此類安全程序應(yīng)包括戴防護手套和避免產(chǎn)生氣溶膠。打開安瓿或小瓶時應(yīng)小心謹慎，以免割傷。

3. 單元

該小組在一項涉及 56 個實驗室和 68 種測試方法的國際合作研究中進行了測試。基因型和共識八種材料中每種材料的突變百分比均來自最一致的方法 NGS 和 dPCR（表 1）。最終用戶能夠使用基于突變體和總的稀釋公式進一步稀釋突變體材料（使用野生型 KRAS 密碼子 12 和 13 材料 16/266，或另一種校準(zhǔn)到材料 16/266 的野生型基因組 DNA） KRAS 拷貝數(shù)，為了在可以實現(xiàn)測定校準(zhǔn)的較低共有突變百分比范圍內(nèi)達到進一步的標(biāo)準(zhǔn)，請參見下面的第 7 節(jié)

4. 內(nèi)容

生物材料原產(chǎn)國：英國。

該組包含八個單獨編碼的安瓿，每個安瓿含有大約 5 µg 從人類細胞系中提取的凍干純化基因組 DNA（材料 16/266 為 25 µg）。使用“鹽析"方法提取基因組 DNA，并在冷凍干燥前用 5mg/ml 海藻糖在 Tris-EDTA 緩沖液中稀釋。

5. 存儲

NIBSC 16/250基因組KRAS密碼子1213突變標(biāo)準(zhǔn) 將所有未開封的凍干材料安瓿存放在 -20°C 或以下。

請注意：由于凍干材料固有的穩(wěn)定性，NIBSC 可以在環(huán)境溫度下運輸這些材料。

6. 開瓶指南

DIN 安瓿瓶有一個“易開"顏色的壓力點，窄的安瓿桿在此與較寬的安瓿瓶主體相連。各種類型的安瓿破碎機可商購獲得。要打開安瓿，輕輕敲擊安瓿以收集底部（標(biāo)記）端的材料，并按照安瓿破碎器隨附的制造商說明進行操作。

7. 材料的使用

在重新配制之前，不應(yīng)嘗試稱量凍干材料的任何部分

a。如上文第 6 節(jié)所述打開安瓿瓶。

b。在室溫下用 100μl 無核酸酶水復(fù)溶凍干材料，除了材料 16/266（野生型 KRAS）應(yīng)用 200μl 無核酸酶水復(fù)溶。

C。使用移液器將每個樣品轉(zhuǎn)移到無核酸酶管中，確保收集最大可用體積。

d。讓材料在室溫下復(fù)溶 1 小時，然后用移液管充分混合。

e.用 300µl 分子生物學(xué)級 1x Tris-EDTA 緩沖液（10mM Tris，1mM EDTA）進一步稀釋僅材料 16/266（野生型 KRAS），并用移液管充分混合，使該材料的總體積為 500µl。

F。在 1x Tris-EDTA 緩沖液中，所有樣本的 DNA 濃度現(xiàn)在約為 50ng/µl。使用前確認 DNA 濃度。不必擔(dān)心材料中可能出現(xiàn)的白色斑點。

G。突變型 KRAS 材料可以與材料 16/266（野生型 KRAS）結(jié)合以產(chǎn)生任何選定突變百分比的標(biāo)準(zhǔn)品；請參閱附錄 I 中的詳細信息。

H。將所需的量添加到您的檢測中。材料可以進一步稀釋（用無核酸酶水或合適的緩沖液），以達到適合您分析的 DNA 濃度。

g。應(yīng)在同一測定中分析初級和二級標(biāo)準(zhǔn)，以將值分配給二級標(biāo)準(zhǔn)。