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在反興奮劑控制中使用 AssayMAP Bravo 樣品制備平臺進行半自動化 GC/Q-TOF 篩查
體育運動中的興奮劑是指對國際體育組織規定的禁用物質和禁用方法的統稱。即除一般物質外，也包括禁用方法和其它生理物質，例如血液、尿液和含有違禁藥物成分的食品添加劑、營養補品、飲料等，只要這些生理物質以“非正常量或通過不正常途徑”攝入人體，均被視為興奮劑。再比如用血液回輸以增強體內紅細胞值的方法、尿液輸入膀胱以逃避檢測的方法，都屬于使用興奮劑。以及一些食品、飲品、補品中含有某種禁止使用且超出限制量的化學成分，也是興奮劑。
為了保持世界反興奮劑機構（WADA）的認證，各興奮劑檢測實驗室不斷努力提高分析方法的靈敏度、選擇性、重現性以及定量能力。不止如此，其對能夠隨時進行回顧性分析的可靠篩查方法的需求也在不斷增加[1]。
GC/MS 作為興奮劑檢測領域的一種重要工具，與 LC/MS 技術互補，可檢測尿樣中需進行篩查的約600種化合物中的400多種。
據 WADA 的統計數據顯示，在過去幾十年中，AAS 一直是檢出最多的興奮劑之一（約占所有檢出物的 50%）。且在近幾年發現了幾種 AAS 的“長期代謝物”。這些代謝物需要耗費更長的時間排出體外，并且濃度往往低于傳統代謝物。硫酸化在這些長期代謝物的形成過程中起著重要作用，并且直到最近，LC/MS/MS 仍被認為是檢測 AAS 硫酸化代謝物的唯一技術。然而近期，已有全新研究證明，通過在熱進樣器中裂解硫酸基團，可以使用 GC/MS 檢測這些硫酸化代謝物[2,3]。與只能檢測硫酸基團丟失的 LC/MS/MS 相比，GC/MS 可以提供更高的分離能力和更多的結構信息。
采用 GC/MS 方法的挑戰在于樣品前處理，可以使用乙酸乙酯液液萃取法（LLE）或固相萃取法（SPE）進行樣品前處理。SPE 具有更高的萃取回收率，以及相應的沖洗程序，可以獲得更潔凈的提取物。此外，SPE 更適合自動化。基于多種需求，Agilent AssayMAP Bravo 系統已成為用于 SPE 自動化樣品前處理的強大平臺。AssayMAP Bravo 是一種微量色譜系統，可使用具有各種表面化學鍵合相的填充樹脂床小柱平行處理 1-96 個樣品。雖然 AssayMAP Bravo 系統通常被用作蛋白質樣品前處理平臺，但本研究表明，與 LLE 方法相比，該系統不僅對硫酸化代謝物具有明顯更高的萃取回收率，對于其他幾乎所有極性化合物也同樣如此。借助小型化流程，減少了廢棄物，進而減少了對環境的影響。由此，我們提出了一種使用 GC/TQ、GC/Q-TOF 和 AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺的統一方法，幫助分析人員在興奮劑檢測應用中實現高效篩查并獲得可靠結果。
圖 1. AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺
實驗部分
樣品
樣品包括使用去除類固醇的尿樣配制的 6 個校準品（繪制用于分析內源性類固醇的校準曲線）、使用去除類固醇的尿樣配制的 4 種不同濃度水平的 4 個質控（QC）樣品、1 個空白水樣、1 個陰性對照尿樣和 84 個真實尿樣。
水解
在 96 孔板中進行樣品前處理。向 0.5 mL 尿樣中加入氘代內標（IS）混合物，并與大腸桿菌 β- 葡萄糖醛酸酶在 pH 7 的磷酸鹽緩沖液中于 56 °C 孵育至少 1 小時。
借助 AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺，使用自動化 SPE 進行樣品萃取
在 AssayMAP Bravo 上使用改良版的多肽凈化應用程序，通過 Agilent AssayMAP 25 µL 反相（RP-S）小柱（貨號 G5496- 60023）進行自動化 SPE（圖 1）。使用 250 µL 甲醇，以 300 µL/min 的流速灌注 RPS 小柱，然后用 100 µL 20% 甲醇以 25 µL/min 的流速進行平衡。將 1 mL 樣品以 25 µL/min 的流速上樣至該小柱。然后用 250 µL 20% 甲醇以 25 µL/min 流速清洗該小柱。收集兩份連續洗脫液（第一份用 75 µL 甲醇以 7.5 µL/min 的流速洗脫，第二份用 75 µL 乙腈以 7.5 µL/min 的流速洗脫），并將其合并。
使用乙酸乙酯液液萃取法進行樣品萃取
按照“水解”一節所述進行水解，但使用帶螺口蓋的單獨玻璃管。將樣品在堿性條件（pH 9.5）下用乙酸乙酯萃取 20 分鐘，并收集有機層。將提取物在 40 °C 下氮吹至干，使用 50 µL MSTFA:NH4I:乙硫醇混合物在 80 °C 下衍生化 30 分鐘。
?數據采集和數據處理
采用兩套系統進行 GC/MS 分析，即 Agilent 7250 GC/Q-TOF 和 Agilent 7000C GC/TQ。創建含有 320 種 WADA 禁止的外源性化合物及其代謝物的精確質量個人化合物數據庫與譜庫（PCDL），以便實施精確質量 GC/Q-TOF 篩查方法。使用 Agilent MassHunter 定性分析軟件（10 版）將精確質量 EI 碎片轉換為理論 m/z 值。然后使用 Agilent PCDL Manager 軟件（8.0 版）將譜圖導入精確質量 PCDL 中。采用 MassHunter 定量分析軟件（10.2 版）進行進一步數據處理。
在興奮劑檢測領域使用 AssayMAP
Bravo 樣品前處理平臺的優勢
與使用 AssayMAP Bravo 系統進行自動化樣品前處理相比，使用乙酸乙酯進行手動樣品萃取明顯更耗時，且效率更低。蒸發 5 mL 乙酸乙酯需要大約 45 分鐘，而對于 150 µL MeOH:ACN，則僅需要 10 分鐘。此外，LLE 涉及額外的樣品轉移步驟，需要 30 分鐘。自動化還可以顯著縮短手動操作時間，因為在樣品前處理過程中分析人員可以離開 AssayMAP Bravo，而采用手動方法時幾乎需要持續關注。使用自動化樣品前處理時，出錯的風險也顯著降低。另外，許多揮發性化合物（主要是興奮劑）會隨乙酸乙酯一起揮發，與自動化 SPE 相比，萃取回收率非常低。此外，加入衍生化試劑后的額外的樣品轉移步驟會導致回收率進一步降低。
使用 GC/Q-TOF 和 GC/TQ 儀器，對 LLE 程序（使用乙酸乙酯）與 AssayMAP Bravo 固相萃取方案的檢出限進行了比較，如圖 2 所示。對于非極性化合物（例如類固醇），使用 AssayMAP Bravo 樣品前處理平臺時 LOD 的改善并不十分明顯，從僅降低百分之幾到降至原來的 1/4 不等。LOD 降至原來的 1/4 是由于 AssayMAP 萃取具有明顯更低的背景。對于極性較強的化合物（例如呋塞米，其最新 LOD 低于 0.4 ng/mL），AssayMAP Bravo 萃取方法的靈敏度是先前LLE萃取方法的 200倍以上，并能在最新 WADA MRPL 下實現檢測（圖 3）。
圖 2. 使用乙酸乙酯 LLE（左）和 AssayMAP Bravo（右）萃取時的 LOD 比較：（A）3-0H- 普羅斯它諾唑，利用 GC/TQ 進行分析；和（B）異美汀，利用 GC/Q-TOF 進行分析。每種萃取技術所對應的 LOD 用紅圈標記
圖 3. 使用 AssayMAP Bravo 進行萃取時得到的呋塞米的 GC/Q-TOF LOD。LOD 用紅圈標記
參考文獻
1. Polet, M.; Van Gansbeke, W.; Van Eenoo, P. Development and Validation of an Open Screening Method for Doping Substances in Urine by Gas Chromatography Quadrupole Timeof-Flight Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 2018, 1042, 52–59. DOI: 10.1016/j.aca.2018.08.050
2. Balcells, G. et al. Detection and Characterization of Clostebol Sulfate Metabolites in Caucasian Population. J. Chromatogr. B. 2016, 1022, 54–63. DOI: 10.1016/j.jchromb.2016.03.028
3. Albertsdóttir, A. D. et al. Searching for New Long-Term Urinary Metabolites of Metenolone and Drostanolone Using Gas Chromatography–Mass Spectrometry with a Focus on NonHydrolysed Sulfates. Drug Test Anal. 2020, 12(8), 1041–1053. DOI: 10.1002/dta.2818