為評(píng)估 SEC 流路中是否存在不銹鋼組件的影響，采用幾種系統(tǒng)或色譜柱組合對(duì) mAb 樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示磷酸鈉在所有測(cè)試組合中均提供了令人滿(mǎn)意的分離性能，HMW 物質(zhì)的回收率良好。當(dāng)用乙酸銨代替磷酸鈉并降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度時(shí)，在流路中存在不銹鋼組件的情況下，分離效果會(huì)受到不利影響。色譜柱硬件的影響使得不銹鋼色譜柱與作為流動(dòng)相的乙酸銨配合使用時(shí)，幾乎無(wú)法檢出 HMW 物質(zhì)（如有）。當(dāng)安裝帶 PEEK 內(nèi)襯的色譜柱并使用 100 mM 乙酸銨運(yùn)行時(shí)，HMW 物質(zhì)重新出現(xiàn)。使用 50 mM 乙酸銨流動(dòng)相（在 MS 靈敏度方面最有利）時(shí)，只有生物兼容性液相色譜系統(tǒng)與帶 PEEK 內(nèi)襯的色譜柱的組合（右下色譜圖）能夠檢出 HMW 雜質(zhì)，提供有用的結(jié)果。

圖 4 進(jìn)一步示出儀器對(duì)峰寬和拖尾的影響。當(dāng)應(yīng)用 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)時(shí)，峰寬始終較小。將磷酸鹽流動(dòng)相替換為與 MS 兼容的乙酸鹽后，峰拖尾也不會(huì)增加。另一方面，當(dāng)不銹鋼液相色譜系統(tǒng)上的流動(dòng)相改變時(shí)，峰寬和拖尾都會(huì)受到嚴(yán)重影響。降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度會(huì)放大這種效應(yīng)。

圖 6 顯示了維布妥昔單抗（一種半胱氨酸偶聯(lián)的 ADC）的 SEC/UV/MS 分析結(jié)果。由于輕鏈和重鏈僅由非共價(jià)相互作用維持，因此如果使用傳統(tǒng)的反相變性條件進(jìn)行質(zhì)譜表征是很難獲得完整蛋白水平數(shù)據(jù)。使用Native SEC-MS進(jìn)行表征，解卷積的譜圖顯示了藥物分布和藥物/抗體比率 (DAR)，以及主要的糖型信息。