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應用文集｜滴度測定“柱”力提高生物制藥關鍵質量屬性
在生物治療藥物的生產過程中，滴度測定用于測量發酵液中目標蛋白質的濃度。在以下兩種重要的情況下，需要進行準確的滴度測定。第一種情況是在克隆選擇過程中，僅選擇那些提供足量目標蛋白質的轉染克隆，因為并非所有克隆都同等有效。第二種情況是在發酵工藝的放大過程中監測目標蛋白質的濃度。細胞培養基條件的優化和最佳收獲時間的確定依靠準確的滴度測定。
親和色譜法
對于單克隆抗體，最有效的滴度測定方法之一是親和色譜法。親和色譜是一種利用特定蛋白之間（如抗原/抗體）高度特異性分子間相互作用的強大分離技術。安捷倫提供了幾種專門的親和產品，包括用于對單克隆抗體 (mAb) 進行分離和定量的Biomonolith Protein A 和 Protein G 色譜柱。
近年來，mAb 已成為可滿足多種疾病治療需求的主要生物制藥產品。這些經特別設計的抗體具有特定的基因構成，能夠更好地以病原為靶標。在這些抗體的開發過程中，Protein A 和 Protein G 分析型親和色譜柱可用于測定各種細胞培養上清液中的抗體滴度或濃度，以選出高產量的克隆。
色譜柱選擇
Protein A 和 G 色譜柱對抗體均具有高親和性，因此它們僅結合細胞培養上清液中的抗體。然而，它們的選擇性各有不同。例如，Agilent Bio-Monolith Protein A 色譜柱對人 IgG1、IgG2 和 IgG4 亞型具有高親和力，對 IgG3 沒有親和性，而 Agilent Bio-Monolith Protein G 色譜柱對人 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 亞型都具有高親和力。IgG1 憑借其穩定性（半衰期較長）、在血清中的豐度以及較少出現聚集，成為最常用的生物治療藥物。通常不使用 IgG3，因為它容易聚集且不太穩定。相反，Protein G 色譜柱對人亞類單克隆抗體（例如 IgA 和 IgD）沒有親和性，但是 Protein A 色譜柱能夠與這些抗體結合（表 1）。這些色譜柱相互補充，Protein G 對不與 Protein A 結合的 mAb 具有親和性，反之亦然（圖 1）。因此，它們能夠實現目前作為生物治療藥物進行開發的各種 mAb 亞類和片段的滴度測定。
*Protein A 和 G 對不同抗體的相對親和性表示法：++++ = 強親和性，+++ = 中等親和性，++ = 弱親和性，+ = 微弱親和性，- = 無親和性。
樣品前處理
親和色譜的樣品前處理方法與 HPLC 蛋白質分析的樣品前處理方法類似。進樣前需要極少的樣品前處理，以優化色譜柱性能并延長色譜柱壽命。
對樣品進行離心或過濾，去除上清液或裂解液中的宿主細胞碎片和顆粒，以防止堵塞色譜柱。
對于血清/血漿樣品，最好去除樣品中的脂類。脂類將與色譜柱發生強結合，導致色譜柱和儀器污染。
快速分離方案
Agilent Bio-Monolith rProtein A（重組 Protein A）分析柱是 Bio-Monolith 和親和色譜家族的新成員。該色譜柱可用于高速分析單克隆抗體 (mAb) 滴度和小規模純化，并可輕松集成到二維液相色譜等其他分析工作流程中。本研究以最大流速測試了重組 Protein A 色譜柱，證明了一種色譜結合/洗脫法可用于測定 mAb 滴度，該方法具有非常短的運行時間（1 分鐘），適用于克隆篩選、工藝開發及優化等高通量應用。
此外，本篇應用文集中還包含使用 Agilent Bio-Monolith Protein A HPLC 色譜柱縮短定量分析人 IgG 的分析周期、使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色譜柱和 LC/MS 進行的細胞培養優化等應用簡報供您查閱。
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