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體外高效電轉化儀的操作要領
胞電轉染(電轉),也叫細胞電穿孔(electroporation),是把外源大分子物質DNA、RNA、siRNA、蛋白質等以及一些小分子導入細胞膜內部的重要方法。
體外高效電轉化儀在瞬間強大電場的作用下,溶液中細胞的細胞膜具有了一定的通透性,帶電的外源物質以類似電泳的方式進入細胞膜。由于細胞膜磷脂雙分子層的電阻很大,細胞外部電流場產生的細胞兩極電壓都被細胞膜承受,細胞質內分到的電壓可以忽略不計,細胞質內部幾乎沒有電流,因此也決定了正常范圍內的電轉過程中細胞毒性很小。電場使DNA等物質進入細胞膜后只能停止在細胞膜附近,隨后細胞本身的機制可以允許這些物質到細胞核等處。
體外高效電轉化儀使用:
1.選擇合適的電場強度合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的*佳場強值,實驗前應測定所轉染細胞系的電場強度。
2.細胞的選擇用于電轉的細胞一般選取處于對數生長期的細胞(15代以內,傳代后2d)。因為處于對數生長期的細胞分裂旺盛,表面結構致密比穩定期的細胞差,電轉后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA。
3.質粒的質量應選擇純度高的質粒,DNA/RNA應該超純(A260/A280>1.8),其次應不含內毒素,同時質粒應溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。另外,DNA濃度不宜過高。
4.選擇合適的電轉染試劑電擊會對細胞造成一定程度的傷害,在轉染試劑的選擇上要注意,應選擇具有細胞膜修復成分的電轉染試劑,如Entranster-E,可將電擊對細胞的損傷降低。