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共聚焦顯微鏡的分辨率受哪些因素影響
閱讀：854 發布時間：2022-8-29
共聚焦顯微鏡，最常見的是共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)或激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)，是一種光學成像技術，可通過使用空間針孔來阻擋散焦光來提高顯微圖像的光學分辨率和對比度。在圖像形成中。捕獲樣品中不同深度的多個二維圖像可重建三維結構(此過程稱為光學切片)。該技術廣泛用于科學和工業界，典型的應用是生命科學、半導體檢查和材料科學。
共聚焦顯微鏡是一種掃描成像技術，通過與其他掃描技術(如掃描電子顯微鏡SEM)進行比較，可以解釋所獲得的分辨率。CLSM的優點是，例如在AFM或STM中，不需要將探針從表面上懸垂納米級，例如，通過在表面上用細小進行掃描即可獲得圖像。從物鏡到表面的距離(稱為工作距離)通常可與常規光學顯微鏡相媲美。它隨系統光學設計的不同而變化，但是典型的工作距離是幾百微米到幾毫米。
在共聚焦顯微鏡CLSM中，樣品由點激光源照射，每個體積元素都與離散的散射或熒光強度相關。在此，掃描體積的大小由光學系統的光斑大小(接近衍射極限)決定，因為掃描激光的圖像不是無限小的點而是三維衍射圖案。此衍射圖樣的大小及其定義的焦點體積由數值孔徑控制系統的物鏡和所用激光的波長。這可以看作是使用廣角照明的傳統光學顯微鏡的經典分辨率極限。但是，通過共聚焦顯微鏡，甚至可以改善寬視場照明技術的分辨率極限，因為可以關閉共聚焦孔以消除更高階的衍射圖。例如，如果針孔直徑設置為1艾里單位那么只有一階衍射圖樣會通過孔徑到達檢測器，而更高的階數會被遮擋，從而以稍微降低亮度的代價提高了分辨率。在熒光觀察中，共聚焦顯微鏡的分辨率極限通常受信噪比限制由熒光顯微鏡中通常可用的少量光子引起的。可以通過使用更靈敏的光電探測器或通過增加照明激光點光源的強度來補償這種影響。增加照明激光的強度可能會對目標樣品造成過度漂白或其他損壞，特別是對于需要比較熒光亮度的實驗。當對屈光不同的組織(例如植物葉片的海綿狀葉肉或其他包含空氣的組織)進行成像時，通常會損害共聚焦圖像質量的球面像差。但是，通過將樣品安裝在光學透明，無毒的全氟化碳(如全氟萘烷)中，可以降低此類像差容易滲入組織，其折射率幾乎與水相同。