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Annexin V-Alexa Fluor 647細胞凋亡檢測試劑盒

包裝規格

產品貨號：FL0020、FL0050、FL0100

規格：20T、50T、100T

儲存條件

4oC 保存，一年有效

產品介紹：

磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS 只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早 期，細胞膜 PS 由脂膜內側翻向細胞膜外側，使 PS 暴露在細胞膜外表面。Annexin V 是一種分子量為 35~36kD 的 Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結 合。因此 Annexin V 被*為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。 Annexin V-Alexa Fluor 647細胞凋亡檢測試劑盒將 Annexin V 進行紅色熒光 Alexa Fluor 647 標記，以標記了的 Annexin V 作為探針，利用熒光顯微鏡或 流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋 亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用 Annexin V 與 PI 雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細 胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞。

注意事項：

1. 此試劑盒僅供研究使用。

2. 微量試劑需離心數秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

4. Annexin V-Alexa Fluor 647 中含有毒成分三氮化鈉（NaN3）, 操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

5. 本試劑盒用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于 1x106。

6. 染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。

7. Annixin V 檢測凋亡細胞的方法適用于懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞，由于 在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測，可將胰酶消化后的細胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防止進一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單 位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復性較差，且需要操作時非常小心。

8. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解 Annexin V-Alexa Fluor 647，最終導致染色失敗。

9. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

圖 1. 細胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖

試劑盒組份：

操作說明：

1. 細胞樣品的準備：

a) 懸浮細胞：

1）收集細胞至離心管中 1000-2000rpm 離心 5min，小心去除上清。

2）用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

3）再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

b) 貼壁細胞：

1）吸出細胞培養液至離心管中，PBS 洗滌貼壁細胞一次，加入適量不含 EDTA 的胰酶細胞消化液消化細胞。

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加入以上步驟中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。 注：加入的細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可 以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續加入的 Annexin V-Alexa Fluor 647 導致染色失敗。

4）用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

5）再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清。

2. 用去離子水按 1：4 稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離子水）；

3. 用 250?l 結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為 1×106/ml；

4. 取 100?l 的細胞懸液于 5 ml 流式管中，加入 5?l Annexin V-Alexa Fluor 647，輕輕混勻；

5. 室溫(20-25oC)避光孵育 10min；

6. 上機前 5min 加入 10?l 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；

7. 上機前在反應管中補加 400?l PBS 重懸細胞， 避光保存，隨即進行流式細胞儀（FACS）檢測， Annexin V-Alexa Fluor 647 和 PI 均為紅色熒光。

圖 2. 流式細胞儀檢測早期凋亡細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞。