5
熒光定量PCR實驗中的常見問題與解決方案
熒光定量PCR實驗中常見的問題及其解決方案對于確保實驗結果的準確性和可靠性至關重要。以下是一些常見問題及其相應的解決方案：
引物或探針降解：引物和探針的降解會影響PCR擴增效率和特異性。解決方案是定期進行PAGE電泳檢測引物和探針的完整性，避免使用降解的引物和探針。
模板量不足或降解：模板DNA或RNA的量不足或降解會導致PCR擴增失敗。解決方案是確保模板的純度和完整性，避免樣品制備過程中的雜質引入和反復凍融。對于未知濃度的樣品，應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
反應循環數不夠：反應循環數不足會導致擴增不足，影響結果的準確性。解決方案是增加循環次數，但需注意避免過高的循環數增加背景信號。
反應條件不夠優化：如退火溫度、Mg2+濃度、dNTPs濃度等反應條件不合適，會影響PCR擴增效率和特異性。解決方案是根據引物的Tm值優化退火溫度，調整Mg2+和dNTPs濃度，以獲得最佳的擴增效果。
加樣誤差：加樣不準確會導致標準品不呈梯度，影響定量結果的準確性。解決方案是確保加樣操作的準確性，使用精確的移液器，并避免交叉污染。
儀器性能不穩定：PCR儀的性能不穩定會影響擴增效率和結果的可靠性。解決方案是定期對PCR儀進行校準和維護，確保儀器性能穩定。
綜上所述，通過注意引物和探針的完整性、模板的純度和量、反應條件的優化、加樣的準確性以及儀器性能的穩定性，可以大大減少熒光定量PCR實驗中的問題，提高實驗的準確性和可靠性。