ClearColi BL21(DE3) 大腸桿菌感受態(tài)細胞
產品信息：
組成 BC215-01
ClearColi BL21(DE3) Competent Cells 10×100µl
pUC19（0.1ng/µl） 5µl
儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融。
產品介紹：
脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是幾乎所有革蘭氏陰性細菌外膜的一種成分。LPS 被哺乳動物免疫細胞上的 TLR4/MD-2 識別，
從而激活 NF-kappB 信號通路，導致生物體炎癥反應的發(fā)生。大腸桿菌基因工程產品中的殘留的 LPS 會極大地影響下游實驗。
ClearColi 系列大腸桿菌的細菌外膜上為修飾后的類脂 IVA((Lipid IVA )，與野生型的 LPS 相比，缺乏寡糖鏈和兩條二級酰基鏈，類
脂 IVA 不能誘導活化的 hTLR4/MD-2 復合物的形成，避免了 LPS-TLR4/NF-kB 信號通路的內毒素反應。此外，不含寡糖的類脂 IVA
更易從重組蛋白中去除。
ClearColi BL21（DE3）細胞的生長速度約為正常 BL21（DE3）細胞的 50%。轉化后的菌落在最初 24 小時內顯得非常小。建議
轉化后的平板先培養(yǎng)皿培養(yǎng) 36-48 小時實驗再挑菌落進行實驗。誘導前，需要更長的生長時間才能達到所需的細胞密度。
pUC19 質粒檢測感受態(tài)細胞的轉化效率大于 10 5 cfu/μg。
基因型：F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm lon λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) msbA148 ?gutQ ?kdsD ?lpxL ?lpxM
?pagP ?lpxP ?eptA
產品特點：
用于表達低內毒素的重組蛋白。該菌株含有 T7 RNA 聚合酶和大腸桿菌 RNA 聚合酶，適用于含有 T7 啟動子的原核表達載體（如
pET 等）和非 T7 啟動子的表達載體（如 pGEX，pMal，pTrc 等載體）在原核系統(tǒng)中的高效表達。
菌株抗性：對氨芐，，，，和四環(huán)素敏感。
質粒轉化步驟：
1. 將感受態(tài)細胞置于冰水浴中化凍。待細胞剛化凍后，加入目的質粒到細胞中，用手指管底，輕輕混勻；
2. 冰水浴中放置 30 分鐘，不要晃動；
3. 42℃熱擊 60 秒鐘，不要晃動；
4. 冰水浴中放置 2 分鐘，不要晃動；
5. 加入 500μl 無菌的 LB 培養(yǎng)基；
6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm 震蕩復蘇培養(yǎng) 60 分鐘；
7. 取 100-200 μl 左右的菌液，涂布于含相應抗生素的 LB 平板上，倒置放于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 36-48 小時。
蛋白質誘導方案:
1. 從平板上挑取一個生長良好的單菌落接種到 10 ml 含有合適抗生素的液體 LB 培養(yǎng)液中。
2. 37°C，200-250 rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。
3. 無菌條件下，接種 8 ml 過夜培養(yǎng)液到 200 ml 含有適當抗生素的 LB 培養(yǎng)液中。或者通過測量 OD600 的方法來決定接種量，最
終 OD600 在 0.1 左右為宜。
4. 37°C，200-250rpm 振蕩培養(yǎng)，直到 OD600 達到 0.6-0.8（約 4-5 小時）。
5. 添加 IPTG 至最終濃度為 0.4-1 mM 進行蛋白的誘導表達。（通過溶解制備 1 M IPTG 溶液將 2.38 g IPTG 放入水中，并將最終
體積調節(jié)至 10 mL。使用前過濾滅菌）。為了確定 IPTG 誘導的濃度，限度地表達目標蛋白，可以用 IPTG 梯度測試使
用濃度。
6. 37℃下振蕩誘導培養(yǎng) 3-4 小時。為了確定目標蛋白質誘導的時間，建議進行時程實驗，誘導時間 2-16 小時。
7. 誘導結束后，5,000×g 離心 10 分鐘收集細胞。
8. 用合適的方法（如考馬斯亮藍染膠法，Western-Blot 法或酶活性分析法）分析菌體裂解物的總蛋白、上清和沉淀組分，明確表
達產物的表達狀況（可溶性或不溶性表達）。
9. 根據表達結果和目的蛋白質的特點制定合適的蛋白質純化方案。
注意事項：
1. ClearColi BL21(DE3)菌株生長緩慢，平板在 37℃培養(yǎng)，時間在 36-48 小時之間。
2. ClearColi BL21(DE3) 細胞外膜中為修飾后的脂質 IVA，適合在高鹽培養(yǎng)基中生長，常用 LB 培養(yǎng)基，不能用 SOB，2×YT 和
3. SOC 等培養(yǎng)基。
4. 感受態(tài)細胞應該在冰水浴中化凍，加入 DNA 后應輕柔混勻，加入 DNA 的體積小于細胞體積的 1/10。


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重組蛋白：多項發(fā)明，原核表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達蛋白 1000 余種。


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