LBA4404(pSoup)農桿菌感受態細胞

產品信息：

組成 BC311-01
LBA4404(pSoup) Chemically Competent Cell 20×100μl
pGs2 (100ng/μl) 1 支
儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融。不適合在液氮中保存。
基因型：Ach5 (rif R ) Ti pAL4404 (strep R ) Octopine pSoup(tetR )
產品介紹：
農桿菌LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有抗性篩選基因rif。為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能
的章魚堿型Ti質粒pAL4404，此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質粒自身的T-DNA轉移功
能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA 順利轉移）。pAL4404型Ti質粒含有篩選標簽基因strep，賦予LBA4404菌株
抗性。一些缺失農桿菌復制相關元件（如pVS1的復制起點REP區或pVS1質粒的STA區）的表達質粒如pGreen、pGreenII-62SK和pGs2等不能在LBA4404菌株中繁殖。輔助質粒pSoup可以幫助這些不完整雙元表達質粒在農桿菌中的復制并使LBA4404(pSoup)菌株具有四環素（Tet）抗性。適用于菸草、番茄和煙草等植物的轉基因操作。LBA4404 (pSoup)農桿菌感受態細胞經特殊工藝制備，經pGs2質粒檢測，轉化效率可達10 3cfu/μg，-70℃保存12個月轉化效率不發生改變。
轉化方法：（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的LBA4404 (pSoup)農桿菌感受態細胞于冰水浴中融化；
2. 無菌條件下，向感受態細胞中加入100ng-1μg質粒DNA（次使用，做一下預實驗，確定所加質粒的量），輕輕
混勻，冰水浴中靜置5 分鐘；
3. 將離心管置于液氮中速凍5分鐘；（注：可用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于37℃水浴中保持5分鐘，不要晃動水面；
5. 將離心管放回冰水浴中，冰浴5分鐘；
6. 無菌條件下加入800μl無抗生素的2xYT、SOB、SOC或LB液體培養基，于28℃振蕩培養2-3小時，菌體復蘇；
7. 6000rpm離心1分鐘收菌，留100μl左右上清，輕輕吹打重懸菌體，取適量菌液，涂布于相應抗生素的LB平板上，于28℃培養
箱中倒置培養48-72小時。（實驗表明當平板只含有50μg/ml的Kan時，28℃培養48 h即可看到菌落；平板中含有50 μg/ml Kan
和20 μg/ml Rif 時，需28℃培養60 h可看到菌落； 如果平板中含有50 μg/ml Kan和50 μg/ml Rif時則需要28℃培養72-90 h可看
到菌落）。
注意事項：
1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化
效率下降一個數量級。
2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。
4. 濃度不應高于25 μg/ml，過高的濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。
5. 培養基中加入的目的是防止雜菌生長和篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti 質粒篩選抗生素可防止Ti 質粒丟失，
但Ti 質粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮這些抗生素，Ti 質粒丟失的概率極低(可以
忽略)。
6. 相關抗生素配制及工作濃度：
（Rif）用DMSO配制成20mg/ml的儲存液，工作濃度為20μg/ml。（Tet）用甲醇溶解成10mg/ml的儲存液，
工作濃度為10μg/ml。硫酸（Kan）、硫酸（Strep）、硫酸（Gent）和羧芐鈉鹽（Carb）分別
用雙蒸水配制成濃度為50mg/ml，50mg/ml、40mg/ml和50mg/ml的儲存液，并用0.22μg濾器過濾除菌。工作濃度分別為
Kan:50μg/ml，Strep:50μg/ml，Gent:40μg/ml和Carb:50μg/ml。


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重組蛋白：多項發明，原核表達系統穩定表達蛋白 1000 余種。


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